Säugetier-Zellteilung in 3D Matrizen über Quantitative konfokale Reflexion Mikroskopie
Summary
Dieses Protokoll effizient studiert Säugetier-Zellteilung in 3D Kollagen Matrizen durch die Integration von Synchronisation der Zellteilung, Überwachung der Abteilung Veranstaltungen in 3D Matrizen mit live-Cell imaging Technik, zeitaufgelöste konfokale Reflexion Mikroskopie und quantitative bildgebende Analyse.
Abstract
Die Studie wie Säugetier-Zellteilung ist geregelt in einer 3D Umgebung bleibt trotz seiner physiologischen Relevanz und therapeutische Bedeutung weitgehend unerforscht. Mögliche Gründe für das Fehlen der Exploration sind die experimentellen Einschränkungen und technischen Herausforderungen, die das Studium der Zellteilung in 3D Culture ineffizient machen. Hier beschreiben wir eine Imaging-basierte Methode, um effizient Säugetier-Zellteilung und Zelle-Matrix-Interaktionen in 3D Kollagen Matrizen zu studieren. Zellen mit fluoreszierenden H2B beschriftet werden synchronisiert mit der Kombination von Thymidin blockieren und Nocodazole Behandlung mit anschließender eine mechanische Shake-off-Technik. Synchronisierte Zellen werden dann in ein 3D Kollagen-Matrix eingebettet. Zellteilung wird mit live-Cell-Mikroskopie überwacht. Die Verformung der Kollagenfasern während und nach der Zellteilung, die ein Indikator der Zellmatrix Interaktion ist, überwacht werden kann und mit quantitativen konfokale Reflexion Mikroskopie quantifiziert. Die Methode stellt eine effiziente und allgemeinen Ansatz zur Säugetier-Zellteilung und Zelle-Matrix Interaktionen in einer physiologisch relevanten 3D-Umgebung zu studieren. Dieser Ansatz bietet neue Einblicke in die molekularen Grundlagen der Entwicklung von Normalgewebe und Krankheiten nicht nur, sondern kann auch für die Gestaltung der neuartige diagnostische und therapeutische Ansätze.
Introduction
Zelle Mitose ist ein kritisches Ereignis im zellularen Lebens, deren Regelung im Gewebe und Organ Entwicklung entscheidende Rolle spielt. Abnorme Mitose ist in natürlichen genetischen Variationen, menschliche Alterungsprozesse und das Fortschreiten von Krebs1,2,3,4,5verwickelt. Die erhöhte Rate von Proliferation von Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen ist eines der Markenzeichen von Krebs, trotz der Tatsache, dass Zelle Verhaltensweisen sehr heterogenen unter verschiedenen Arten von Tumoren und auch unter den Patienten sind. Trotz vielversprechender präklinische Ergebnisse zeigten einige neu entwickelte antimitotic Medikamente nicht wirksam in klinischen Studien6,7,8,9,10 ,11. Die Relevanz der experimentellen und präklinischen Modellen muss sorgfältig geprüft werden. Viele Arten von normalen Säugetieren und Krebs Zellen unterteilen in dreidimensionale (3D) Matrizen, wie z. B. Fibroblasten und Fibrosarkom Zellen Kollagen-reiche 3D Bindegewebe und metastatischen Krebszellen in der 3D Stromazellen extrazelluläre Matrix (ECM). Allerdings sind die überwiegende Mehrheit der Säugetier-Zellteilung Experimente und Tests an Zellen auf zweidimensionale (2D) Substraten kultiviert durchgeführt worden. Eine veränderte 3D Matrix könnte besser rekapitulieren die Mikrostruktur, mechanischen Eigenschaften und biochemische Signale des 3D ECM sowohl normale und pathologische Gewebe12,13,14, 15,16,17.
Die Studie von wie Säugetier-Zellteilung reguliert in 3D Umgebungen bleibt weitgehend unerforscht, obwohl die physiologische Relevanz und therapeutische Bedeutung18,19. Mögliche Gründe sind die technischen Schwierigkeiten und experimentelle Herausforderungen im Zusammenhang mit dem Studium Zellteilung in 3D Matrizen. Mitose der Zelle bildet einen zeitliche Bruchteil in der ganzen Zellzyklus-20. Bisherigen Arbeit hat gezeigt, dass die Proliferationsrate von vielen Säugerzellen, wie menschliche Muttermilch Adenokarzinom MCF-7, menschlichen Osteosarkom U2OS und menschlichen Leber HepG2, ist viel niedriger in 3D Matrizen verglichen mit ihren Gegenstücken auf 2D Substrate21, 22. Darüber hinaus bewegen sich Zellen eingebettet in 3D Matrizen ein-und Fokus während live Cell Imaging. All diese Faktoren tragen zur extrem niedrige Effizienz Zellteilung Veranstaltungen in 3D Culture mit bildgebenden Verfahren zu erfassen.
Interaktionen zwischen den ECM und Zellen spielen wichtige Rolle bei der Regulierung der Zellteilungen. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Säugetier-Zellteilung in 3D Kollagen Matrizen effizient studieren. Die Methode beinhaltet die Einbeziehung der mitotischen Markierungen, um die Zellen, Synchronisation der Zellteilung sowie die Überwachung der Abteilung Veranstaltungen in 3D mit dem Leben-Zelle bildgebendes Verfahren, zeitaufgelöste konfokale Reflexion Mikroskopie, Matrizen und quantitative bildgebende Analyse. Fluoreszenz-markierten Histon Protein H2B als Marker zu differenzieren mitotischen und interphase Zellen zuerst in die Zellen eingebracht. Dann werden die Zellen synchronisiert mit der Kombination von Thymidin blockieren und Nocodazole Behandlung mit anschließender eine mechanische Shake-off-Technik. Synchronisierte Zellen werden dann direkt in 3D Kollagen Matrizen gekapselt. Zellteilung Ereignisse mehrerer Zellen werden effizient durch Low-Vergrößerung Zeitraffer live Cell Imaging überwacht. Die Verformung der Kollagenfasern, die ein Indikator der Zellmatrix Interaktion ist, wird mit der Reflexion der konfokalen Mikroskopie bei hoher Vergrößerung überwacht.
Wir haben früher diese Technik zu überwachen und zu quantifizieren Zellmatrix Interaktion vor, während und nach der Mitose zwei metastasiertem Krebs-Zelllinien, menschliche invasives Duktales Karzinom MDA-MB-231 und menschlichen Fibrosarkom HT1080 Zellen in 3D Kollagen Matrizen-19. Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen einen effizienten und allgemeinen Ansatz um beide Säugetieren Zellteilung in einer 3D Umgebung und Zelle-Matrix Interaktionen zu untersuchen. Die MDA-MB-231-Zell-Linie dient als ein Beispiel in dem Papier. Dieses Protokoll bietet neue Einblicke in die molekularen Grundlagen der Entwicklung von Normalgewebe und Krankheiten, und könnte auch für die Gestaltung der neuartige diagnostische und therapeutische Ansätze ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorherige Studie der Zellteilung in 3D war nicht effizient durch experimentelle Einschränkungen und technischen Herausforderungen18,19. Die entscheidenden Schritte für effiziente Untersuchung von Säugetieren Zellteilung in 3D Kollagen Matrizen sind: (1) die Aufnahme der Fluoreszenz-markierten mitotischen Marker zu den Zellen; (2) die Synchronisation der Zellteilung; (3) die Überwachung der Abteilung Veranstaltungen in 3D Matrizen mit live Cell imaging Tec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH unterstützt R01CA174388 und U54CA143868 gewährt. Die Autoren möchte die PURA-Auszeichnung von der Johns Hopkins University für die Unterstützung von Chen Wei-Tong anerkennen. Dieses Material basiert auf Arbeit von der National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter Grant Nr. 1232825 unterstützt.
Materials
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
References
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