У млекопитающих деление клеток в 3D матрицы через количественного отражения конфокальная микроскопия

Summary

Этот протокол эффективно исследования млекопитающих деление клеток в 3D Коллагеновые матрицы путем включения синхронизации деления клеток, мониторинг событий отдел в 3D матрицы, методом клеток изображений, время решена конфокальный отражение микроскопии и количественный анализ изображений.

Abstract

Изучение как млекопитающих клеточного деления регулируется в 3D окружающей среды остается в значительной степени неизученными, несмотря на его физиологическое значение и терапевтическое значение. Возможные причины отсутствия разведки являются экспериментальные ограничения и технические проблемы, которые делают исследования клеточного деления в 3D культуре неэффективно. Здесь мы описываем метод на основе изображений для эффективного изучения млекопитающих деление клеток и клеток матрица взаимодействий в 3D Коллагеновые матрицы. Клетки, помечены флуоресцентные H2B синхронизируются с помощью комбинации тимидина блокировки и Нокодазол лечения, следуют механическая техника трясти off. Синхронизированные клетки затем внедряются в 3D коллагеновой матрицы. Деление клеток контролируется с помощью микроскопии клеток. Деформации волокон коллагена во время и после деления клеток, которая является показателем взаимодействия клеток матрица, может контролироваться и количественно с помощью количественного отражения конфокальная микроскопия. Этот метод предоставляет эффективный и общий подход для изучения млекопитающих деление клеток и клеток матрица взаимодействия в физиологически соответствующих 3D-среде. Этот подход не только обеспечивает Роман понимание молекулярные основы развития нормальной ткани и болезней, но также позволяет для разработки новых диагностических и терапевтических подходов.

Introduction

Митоз клеток является критически важных событий в клеточных жизни, регулирование которых играет решающую роль в развитии тканей и органов. Аномальные митоз причастны естественных генетических вариаций, процессы старения человека и прогрессирование рака^1,2,3,4,5. Возросшими масштабами распространения клеток опухоли, по сравнению с нормальной клетки является одним из отличительных признаков рака, несмотря на тот факт, что поведение клеток весьма неоднородны, среди различных типов опухолей и даже среди пациентов. Несмотря на многообещающие результаты доклинических некоторых недавно разработанных antimitotic препаратов не показали, чтобы быть эффективным в клинических испытаниях^{6,,78,9,10 ,11}. Значимость экспериментальные и доклинических моделей должна рассматриваться. Многие типы нормальных клеток млекопитающих и рак разделить в трехмерной (3D) матрицы, например фибробластов и фибросаркома клетки в коллагена-богатые 3D соединительной ткани и метастатическим раком клетки в 3D стромальные внеклеточного матрикса (ECM). Однако подавляющее большинство млекопитающих деление клеток экспериментов и анализы были проведены на клетки культивировали на двухмерный (2D) подложках. Инженерии 3D матрицы может лучше пилки микроструктуры, механические свойства и биохимические сигналов 3D ECM как нормальной и патологической ткани^{12,13,14, 15,16,17}.

Изучение как млекопитающих клеточного деления регулируется в 3D средах остается в значительной степени неизученными несмотря на физиологические актуальность и терапевтическое значение^18,19. Возможные причины включают в себя технические трудности и экспериментальной проблемы, связанные с изучением деление клеток в 3D матрицы. Митоз клеток является небольшая временная в весь цикла клетки²⁰. Предыдущие работы показал, что темпы распространения многих клеток млекопитающих, например аденокарциномы молочной железы человека MCF-7, человека остеосаркома U2OS и человеческой печени в 3D матрицы, по сравнению с их коллегами на 2D субстратов^{21, HepG2, гораздо меньше 22}. Кроме того клетки, встроенных в 3D матрицы въезжать фокус во время клеток. Все эти факторы способствуют чрезвычайно низкая эффективность захвата события деление клеток в культуре 3D, используя методы визуализации.

Взаимодействие между ECM и клетки играют решающую роль в регулировании клеточных делений. Здесь мы опишем подход для эффективного изучения млекопитающих деление клеток в 3D Коллагеновые матрицы. Метод включает включение митотическая маркеров для клетки, синхронизации деления клеток, а также мониторинг событий отдел в 3D матрицы с использованием клеток Тепловизионная техника, время решена конфокальный отражение микроскопии, и количественный анализ изображений. Флуоресцировани обозначенного гистоновых белков H2B впервые введен в клетки как маркер дифференцировать митотическая и межфазное клетки. Затем ячейки синхронизируются с помощью комбинации тимидина блокировки и Нокодазол лечения, следуют механическая техника трясти off. Синхронизированные клетки непосредственно инкапсулированы в 3D Коллагеновые матрицы. Деление клеток события нескольких ячеек контролируются, эффективно используя низким увеличение покадровой клеток изображений. Деформации волокон коллагена, который является показателем взаимодействия клеток матрица, контролируется с помощью микроскопии конфокальный отражения в высокого увеличения.

Ранее мы использовали этот метод для мониторинга и количественной оценки взаимодействия клеток матрицы до, во время и после митоза двумя метастатического рака клеточных линий, человека инвазивной протоковой карциномы MDA-MB-231 и человека фибросаркома HT1080 клеток, в 3D коллагена матрицы¹⁹. Представленные здесь методы обеспечивают эффективный и общий подход к изучить оба млекопитающих деление клеток в 3D окружающей среды и клеток матрица взаимодействия. MDA-MB-231 клеточная линия используется в качестве примера во всем документе. Этот протокол обеспечивает Роман понимание молекулярные основы развития нормальной ткани и болезней, а также может позволить для разработки новых диагностических и терапевтических подходов.

Protocol

Протокол следует указаниям из Хоумвуд институционального обзора Совет (HIRB). 1. стабильная выражение H2B-mCherry как маркер для клетки митоз Поколение лентивирусные частиц из человеческих эмбриональных почек 293T (ГЭС 293T) клетки Пластина ГЭС 293T клеток на 10 см …

Representative Results

Цель этой статьи заключается в представлении на основе изображений метод для изучения млекопитающих деление клеток процессы в 3D матрицы и дать количественную оценку взаимодействий между ячейкой и 3D внеклеточного матрикса, во время и после деления клеток. Для облегче…

Discussion

Предыдущие исследования клеточного деления в 3D не был эффективно из-за экспериментальной ограничения и технические проблемы^18,19. Важнейшие шаги для эффективного изучения млекопитающих деления клеток в 3D Коллагеновые матрицы являются: (1) включение флуор…

Materials

Human embryonic kidney 293T	ATCC
MDA-MB-231	Physical Sciences Oncology Center, NIH
DMEM	Corning	10-013-CV
DMEM powder	ThermoFisher Scientific	12100-046
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03
Penicillin-Streptomycin 100X	Sigma-Aldrich	P0781
Fugene HD	Promega	E2311
Lipofectamine 2000	Life technologies	11668-07
Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector	Addgene	plasmid 21217
Thymidine	Sigma-Aldrich	T1895
Nocodazole	Sigma-Aldrich	M1404
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070
Sodium bicarbonate	GibcoBRL	11810-025
HEPES	Sigma-Aldrich	113375-100
Collagen	Corning	354236
NaOH	J.T. Bake	3722-01
Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm	Millipore	SLHVM33RS
Nikon TE2000E epifluorescence microscope	Nikon	TE2000E
Cascade 1K CCD camera	Roper Scientific
NIS-Elements AR imaging software	Nikon
Nikon A1 confocal microscope	Nikon	A1