Zoogdieren celdeling in 3D-Matrices via reflectie van kwantitatieve confocale microscopie
Summary
Dit protocol bestudeert efficiënt zoogdieren celdeling in 3D collageen matrices door de integratie van de synchronisatie van de celdeling, toezicht op divisie gebeurtenissen in 3D-matrices met behulp van live-cel beeldvormende techniek, time-resolved confocal reflectie microscopie en kwantitatieve analyse van beeldvorming.
Abstract
De studie van hoe zoogdieren celdeling wordt geregeld in een 3D omgeving blijft grotendeels onontgonnen ondanks de fysiologische relevantie en therapeutische betekenis. Mogelijke redenen voor het ontbreken van exploratie zijn de experimentele beperkingen en technische uitdagingen die de studie van celdeling in 3D cultuur inefficiënt. Hier beschrijven we een imaging gebaseerde methode om te studeren efficiënt zoogdieren celdeling en cel-matrix interacties in 3D collageen matrices. Cellen die zijn gelabeld met de fluorescerende H2B worden gesynchroniseerd met behulp van de combinatie van thymidine blokkeren en nocodazole behandeling, gevolgd door een mechanische schok-off techniek. Gesynchroniseerde cellen worden vervolgens ingebed in een 3D collageen-matrix. Celdeling wordt gecontroleerd met behulp van live-cel microscopie. De vervorming van de collageenvezels tijdens en na de celdeling, die een indicator van cel-matrix interactie is, kan worden gecontroleerd en gekwantificeerd aan de hand van kwantitatieve confocal reflectie microscopie. De methode biedt een efficiënte en algemene aanpak om te bestuderen van zoogdieren celdeling en cel-matrix interacties in een fysiologisch relevante 3D-omgeving. Deze aanpak biedt nieuwe inzichten in de moleculaire basis van de ontwikkeling van normale weefsel en ziekten, maar voorziet ook in het ontwerp van nieuwe diagnostische en therapeutische benaderingen.
Introduction
Cel mitose is een kritieke gebeurtenis in het cellulaire leven, de verordening die cruciale rol bij weefsel- en orgaanbanken ontwikkeling speelt. Abnormale mitose is betrokken bij de natuurlijke genetische variaties, menselijke veroudering processen en de progressie van kanker1,2,3,4,5. Het toegenomen tempo van de verspreiding van tumorcellen in vergelijking met normale cellen is één van de kenmerken van de kanker, ondanks het feit dat cel gedragingen vrij heterogene tussen verschillende soorten tumoren en zelfs patiënten zijn. Ondanks veelbelovende preklinische resultaten, hebben sommige nieuw ontwikkelde antimitotische geneesmiddelen niet aangetoond effectief te zijn in klinische proeven6,7,8,9,10 ,11. De relevantie van experimentele en preklinische modellen moet worden beschouwd. Vele soorten normale zoogdier- en kanker cellen verdelen in driedimensionale (3D) matrices, zoals fibroblasten en cellen van de fibrosarcoma in de collageen-rijke bindweefsels 3D metastatische kankercellen in de 3D stromale extracellulaire matrix (ECM). Echter, de overgrote meerderheid van zoogdieren celdeling experimenten en testen zijn uitgevoerd op cellen gekweekt op tweedimensionale (2D) substraten. Een gemanipuleerde 3D matrix kan beter recapituleren de microstructuur, mechanische eigenschappen en biochemische signalen voor de 3D ECM van beide normale en pathologische weefsels12,13,14, 15,16,17.
De studie van hoe zoogdieren celdeling wordt geregeld in 3D omgevingen blijft grotendeels onontgonnen ondanks de zowel de fysiologische relevantie en het belang van de therapeutische18,19. Mogelijke redenen zijn de technische problemen en experimentele uitdagingen in verband met het bestuderen van de celdeling in 3D-matrices. Cel mitose vormt een kleine tijdelijke breuk in de celcyclus20. Eerdere werkzaamheden is gebleken dat het tempo van de proliferatie van veel cellen van zoogdieren, zoals menselijke borst adenocarcinoom MCF-7, menselijke Osteosarcoom U2OS en menselijke lever HepG2, is veel lager in 3D-matrices in vergelijking met hun tegenhangers op 2D substraten21, 22. Bovendien verplaatsen cellen ingebed in 3D-matrices in en uit focus tijdens live-cel imaging. Al deze factoren bijdragen tot de extreem lage efficiëntie van het vastleggen van de celdeling gebeurtenissen in 3D cultuur met behulp van beeldvormende technieken.
Interacties tussen de ECM en cellen spelen een belangrijke rol bij het reguleren van celdelingen. Hier beschrijven we een aanpak efficiënt studeren zoogdieren celdeling in 3D collageen matrices. De methode omvat de opname van de mitotische markeringen aan de cellen, synchronisatie van celdeling, evenals de controle van de divisie gebeurtenissen in 3D-matrices met behulp van de live-cel beeldvormende techniek, time-resolved confocal reflectie microscopie, en kwantitatieve analyse van beeldvorming. Fluorescentie-geëtiketteerden Histon eiwit H2B is het eerst geïntroduceerd in de cellen als een marker te differentiëren mitotische interfase cellen. De cellen worden vervolgens gesynchroniseerd met de combinatie van thymidine blokkeren en nocodazole behandeling, gevolgd door een mechanische schok-off techniek. Gesynchroniseerde cellen worden vervolgens rechtstreeks ingekapseld in 3D collageen matrices. Celdeling gebeurtenissen van meerdere cellen worden gecontroleerd efficiënt met lage-vergroting time-lapse live-cel imaging. De vervorming van collageenvezels, die een indicator van cel-matrix interactie is, wordt gecontroleerd met behulp van de reflectie van de confocal microscopie bij high-vergroting.
We hebben eerder deze techniek gebruikt om te controleren en te kwantificeren van cel-matrix interactie vóór, tijdens en na de mitose van twee metastatische kanker cellijnen, menselijke invasief ductaal carcinoma MDA-MB-231 en menselijke fibrosarcoma HT1080 cellen, in 3D collageen matrices19. De hier gepresenteerde methoden bieden een efficiënte en algemene aanpak om te studeren zowel zoogdieren celdeling in een 3D omgeving en cel-matrix interacties. De MDA-MB-231 cellenvariëteit wordt gebruikt als een voorbeeld in het papier. Dit protocol biedt nieuwe inzichten in de moleculaire basis van de ontwikkeling van normale weefsel en ziekten, en kan ook leiden tot het ontwerp van nieuwe diagnostische en therapeutische benaderingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De eerdere studie van celdeling in 3D was niet efficiënt als gevolg van experimentele beperkingen en technische uitdagingen18,19. De kritische stappen voor efficiënte studie van zoogdieren celdeling in 3D collageen matrices zijn: (1) de opneming van fluorescentie-geëtiketteerden mitotische markeringen aan de cellen; (2) de synchronisatie van de afdeling van de cel; en (3) de bewaking van de divisie gebeurtenissen in 3D-matrices met behulp van live-cel beeldvor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de NIH grants R01CA174388 en U54CA143868. De auteurs wil erkennen de PURA award van de Johns Hopkins University voor ondersteuning van Wei-tong Chen. Dit materiaal is gebaseerd op werk gesteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder Grant nr. 1232825.
Materials
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
References
- Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
- Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11 (1), 18-21 (2001).
- Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. The Mechanobiology of Aging. Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68 (15), 6251-6259 (2008).
- Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25 (5), 471-477 (2007).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18 (1), 51-63 (2012).
- Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28 (18), 3015-3022 (2010).
- Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127 (1), 63-69 (2012).
- Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22 (2), 431-437 (2011).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
- Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27 (10), 4089-4099 (2013).
- Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719 (2012).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205 (2), 155-162 (2014).
- He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7 (6), 6994-7011 (2016).
- Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7 (9), 747-754 (2010).
- Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7 (10), e48024 (2012).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
- Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763 (2013).
- Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187 (4), 481-496 (2009).
- Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (5), 1943-1948 (2011).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
- Jackman, J., O’Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
- Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120 (2-3), 151-159 (1983).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
- Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8 (11), e82382 (2013).
- Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
- Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6 (9), e24891 (2011).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28 (6), 305-310 (2006).
- Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580 (2015).
- Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9 (14), 932-938 (2002).
- Ma, H. T., Poon, R. Y. Synchronization of HeLa cells. Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).
