División de célula mamífera en Matrices 3D mediante microscopia de reflexión Confocal cuantitativa
Summary
Este protocolo eficientemente estudios División de célula mamífera en matrices de colágeno 3D mediante la integración de sincronización de la división celular, monitoreo de eventos de la división de matrices 3D utilizando la técnica de imágenes de células vivas, la microscopia confocal tiempo-resolved de la reflexión cuantitativos y análisis de imágenes.
Abstract
El estudio de mamífero como la división celular está reglamentado en un 3D medio ambiente sigue siendo en gran parte inexplorado a pesar de su importancia fisiológica y significación terapéutica. Posibles razones de la falta de exploración son las limitaciones experimentales y desafíos técnicos que hacen el estudio de la división celular en 3D cultura ineficiente. Aquí, describimos un método basado en la proyección de imagen para estudiar eficientemente mamífera división celular y las interacciones célula-matriz en matrices de colágeno 3D. Las células marcadas con fluorescente H2B se sincronizan mediante la combinación de tratamiento de bloqueo y nocodazole timidina, seguido por una técnica mecánica de agitar. Sincronizado las células entonces están incrustadas en una matriz de colágeno 3D. División de célula se controla mediante microscopía de células vivas. La deformación de las fibras de colágeno durante y después de la división celular, que es un indicador de la célula-matriz de interacción, puede controlarse y cuantificada mediante microscopía de reflexión confocal cuantitativa. El método proporciona un enfoque eficaz y general para estudiar mamífera división celular y las interacciones célula-matriz en un entorno 3D fisiológicamente relevante. Este enfoque no sólo proporciona nuevas penetraciones en la base molecular del desarrollo del tejido normal y las enfermedades, sino que también permite el diseño de nuevos enfoques diagnósticos y terapéuticos.
Introduction
Mitosis de la célula es un evento crítico en la vida celular, la regulación de la que juega un papel crucial en el desarrollo de órganos y tejidos. Mitosis anormales está implicado en las variaciones genéticas naturales, procesos del envejecimiento humano y la progresión del cáncer1,2,3,4,5. El aumento de la tasa de proliferación de células tumorales en comparación con las células normales es una de las características distintivas del cáncer, a pesar de que comportamientos de la célula son muy heterogéneos entre los diferentes tipos de tumores y aún entre los pacientes. A pesar de resultados preclínicos prometedores, algunas drogas antimitótica desarrollado recientemente no han demostrado ser eficaces en ensayos clínicos6,7,8,9,10 ,11. La relevancia de los modelos experimentales y preclínicas debe ser considerada. Muchos tipos de células de mamíferos y cáncer normales se dividen en matrices (3D) tridimensionales, tales como fibroblastos y células de fibrosarcoma en colágeno-ricos 3D tejidos conectivos y células de cáncer metastásico en la matriz extracelular stromal 3D (ECM). Sin embargo, la gran mayoría de mamíferos división celular experimentos y ensayos se han realizado en células cultivadas en substratos bidimensionales de (2D). Una matriz 3D ingeniería mejor podría recapitular la microestructura, propiedades mecánicas y las señales bioquímicas de la ECM 3D de ambos tejidos normales y patológicos12,13,14, 1516,de,17.
El estudio de mamífero como la división celular está reglamentado en 3D entornos sigue siendo en gran parte inexplorado a pesar de la relevancia fisiológica y la importancia terapéutica de18,19. Posibles razones incluyen las dificultades técnicas y desafíos experimentales asociados con el estudio de división celular en matrices 3D. Mitosis de la célula constituye una pequeña fracción temporal en el ciclo celular completo20. Trabajos previos han demostrado que la tasa de proliferación de muchas células mamíferas, tales como adenocarcinoma de mama humano MCF-7 y osteosarcoma humano U2OS hígado humano HepG2, es mucho menor en matrices 3D en comparación con sus contrapartes en sustratos 2D21, 22. Además, las células embebidas en matrices de 3D se mueven dentro y fuera de foco durante la proyección de imagen de células vivas. Todos estos factores contribuyen a la muy baja eficiencia de captura de eventos de la división de célula en cultura 3D utilizando técnicas de imagen.
Interacciones entre las ECM y las células juegan un papel crítico en la regulación de las divisiones de célula. Aquí, describimos un enfoque para el estudio eficiente división de célula mamífera en matrices de colágeno 3D. El método incluye la incorporación de marcadores mitóticas de las células, sincronización de la división celular, así como el seguimiento de eventos de la división de matrices 3D usando una técnica de imágenes de células vivas, la microscopia confocal tiempo-resolved de la reflexión, y Análisis de imagen cuantitativo. Proteína de fluorescencia etiquetada histona H2B se introdujo en las células como marcador para diferenciar mitosis y células de interfase. A continuación, las células están sincronizadas utilizando la combinación de tratamiento de bloqueo y nocodazole timidina, seguido por una técnica mecánica de agitar. Sincronizado las células luego se encapsulan directamente en matrices de colágeno 3D. Eventos de la división celular de células múltiples están controlados eficientemente usando proyección de imagen de células vivas Time-lapse bajo magnificación. La deformación de las fibras de colágeno, que es un indicador de la célula-matriz de interacción, se controla mediante microscopía confocal de la reflexión a alta magnificación.
Anteriormente hemos utilizado esta técnica para controlar y cuantificar la interacción célula-matriz antes, durante y después de la mitosis de dos líneas celulares de cáncer metastásico, carcinoma ductal infiltrante humano MDA-MB-231 y las células humanas de fibrosarcoma HT1080, colágeno 3D matrices de19. Los métodos presentados aquí ofrecen un enfoque eficaz y general para estudiar ambos mamíferos división celular en un 3D interacciones célula-matriz y entorno. La línea de celular MDA-MB-231 se utiliza como un ejemplo en el papel. Este protocolo proporciona nuevas penetraciones en la base molecular del desarrollo del tejido normal y las enfermedades y también podría permitir el diseño de nuevos enfoques diagnósticos y terapéuticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El estudio previo de la división celular en 3D no fue eficiente debido a limitaciones experimentales y desafíos técnicos18,19. Los pasos críticos para el estudio eficaz de la división de célula mamífera en matrices de colágeno 3D son: (1) la incorporación de marcadores mitotic marcados con fluorescencia en las células; (2) la sincronización de la división celular; y (3) el monitoreo de eventos de la división de matrices 3D utilizando la técnica de i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los NIH concede R01CA174388 y U54CA143868. Los autores desean reconocer la concesión PURA de la Universidad de Johns Hopkins para la ayuda de Chen Wei tong. Este material está basado en trabajo apoyado por la nacional ciencia Fundación graduados beca de investigación bajo la subvención no. 1232825.
Materials
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
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