哺乳類の細胞分裂量的共焦点反射顕微鏡を介して 3 D 行列
Summary
このプロトコルは細胞分裂の同期を統合することで効率的に 3 D コラーゲン マトリックス中の哺乳類の細胞分裂を研究生細胞イメージング、共焦点反射の時間分解顕微鏡を使用して 3 D の行列の部イベントの監視定量画像解析。
Abstract
どの哺乳類の細胞分裂の研究の規制 3 d 環境生理学的な関連性や治療の意義にもかかわらず主として未踏のままです。探査の欠如の原因は、実験的限界と非効率的な三次元培養における細胞分裂の研究をレンダリング技術の課題です。ここでは、哺乳類の細胞分裂と細胞マトリックス 3 D コラーゲン マトリックス相互作用を効率的に勉強するイメージング ベースの方法をについて説明します。蛍光 H2B の付いたセルは、機械的振り払いテクニックが続きます、チミジンをブロックし、ノコダゾール治療の組み合わせを使用して同期されます。同期セルに 3 D コラーゲン マトリックスに埋め込まれています。細胞分裂は細胞の顕微鏡を使用して監視されます。コラーゲン線維の変形中に、細胞分裂、細胞マトリックスの相互作用の指標である後の監視し、量的共焦点反射の顕微鏡検査を使用して量を示されます。メソッドは、哺乳類の細胞分裂と細胞マトリックス相互作用の生理学的関連性の高い 3 D 環境での勉強を効率的かつ一般的なアプローチを提供します。このアプローチは、正常組織および病気の開発の分子基盤に新しい洞察力を提供するだけでなく、新規診断と治療的アプローチの設計ができます。
Introduction
細胞分裂は、うち規制組織や臓器の開発において重要な役割を果たしている細胞の生命の重大なイベントです。異常な細胞分裂、自然な遺伝的変異、ヒトの老化プロセス、およびがん1,2,3,4、5の進行に関与しています。正常細胞と比較して腫瘍細胞の増殖の増加率は、癌細胞の挙動は腫瘍の種類と患者の中でもかなり異質であるという事実にもかかわらずの特徴のひとつです。前臨床試験の有望な結果にもかかわらずいくつかの新たに開発された抗がん剤薬が臨床試験6,7,8,9,10 に有効であるには表示されません。、11。実験および臨床モデルの妥当性は考慮すべき。三次元 (3 D) マトリックス、線維芽細胞とコラーゲンが豊富な 3 D 結合組織、線維肉腫細胞 3 D 間質の細胞外マトリックス (ECM) の転移性癌細胞などの正常な哺乳類やがん細胞の多くの種類を分けます。ただし、二次元 (2 D) 基板上に培養した細胞を実験哺乳類の細胞分裂との試金の大半を行った。組織, 機械的性質および両方正常と病理組織12,13,14,の 3 D の ECM の生化学的なシグナルを設計された 3 D マトリックスが要約より15,16,17。
どの哺乳類の細胞分裂の研究の規制環境が生理学的な関連性や治療の意義18,19にもかかわらず主未踏のまま 3 D で。技術的な問題と 3 D マトリックスの細胞分裂の勉強に関連する実験課題がある可能性があります。細胞分裂は、全体の細胞周期20のほんの時間を構成します。前の仕事は人間の乳房腺 MCF 7、ひと骨肉腫 U2OS、人間の肝臓などの多くの哺乳類細胞の増殖率を示す 2D 基板21、相手と比較して 3 D の行列の hepg2 細胞がはるかに低い 22。さらに、3 D マトリックスに埋め込まれた細胞は、フォーカスのうち住セルイメージ投射の間に移動します。これらすべての要因は、イメージング技術を用いた三次元培養における細胞分裂イベントのキャプチャの非常に低い効率に貢献します。
ECM と細胞間相互作用は、細胞分裂の調節に重要な役割を再生します。ここでは、3 D コラーゲン マトリックス中の哺乳類の細胞分裂を効率的に勉強する方法をについて説明します。メソッドは、細胞、細胞分裂、同期生細胞イメージング、共焦点反射の時間分解顕微鏡を使用して 3 D の行列の部イベントの監視に分裂のマーカーの取り込みを含むと定量的画像解析。蛍光標識ヒストン H2B が最初に導入された細胞に細胞分裂を区別し、中間期の細胞マーカーとして。その後、セルは、機械的振り払いテクニックが続きます、チミジンをブロックし、ノコダゾール治療の組み合わせを使用して同期されます。3 D コラーゲン マトリックスに同期された細胞が直接カプセル化されます。複数のセルの細胞分裂イベントは、効率的に低倍率のタイムラプス住セルイメージ投射を使用して監視されます。細胞マトリックスの相互作用の指標となるコラーゲン線維の変形は、高倍率で反射共焦点の顕微鏡検査を使用して監視されます。
監視し前に、中、後 2 つの転移性癌細胞株、ひと浸潤性膵癌 MDA MB 231、3 D コラーゲンのひと線維肉腫 HT1080 細胞の有糸分裂細胞マトリックスの相互作用を定量化するこのテクニックを使いました以前行列19。紹介した方法は、3 D 環境と細胞マトリックスの相互作用で両方の哺乳類の細胞分裂の研究に効率的で一般的なアプローチを提供します。MDA MB 231 細胞ラインは、ホワイト ペーパーで例として使用されます。このプロトコルは正常組織および病気の開発の分子基盤に新しい洞察力を提供し、新規診断と治療的アプローチの設計もできます。
Protocol
Representative Results
Discussion
3 D の細胞分裂の前の研究は、実験的限界と技術的な課題18,19による効率的でした。3 D コラーゲン マトリックス中の哺乳類の細胞分裂の学習の効率化のための重要なステップは、: (1); 細胞分裂マーカーの蛍光標識定款(2) 細胞分裂; の同期(3) 生細胞イメージング、共焦点反射の時間分解顕微鏡と定量的イメージング解析を用いた 3 D マトリックス部?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH によって支えられた R01CA174388 と U54CA143868 を与えます。著者は魏堂陳のサポートのためのジョンズ ・ ホプキンス大学からプラ賞を認めたいと思います。この資料は、国立科学財団大学院研究奨学金助成金第 1232825 の下に支えられて仕事に基づいています。
Materials
| Human embryonic kidney 293T | ATCC | ||
| MDA-MB-231 | Physical Sciences Oncology Center, NIH | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM powder | ThermoFisher Scientific | 12100-046 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin-Streptomycin 100X | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Lipofectamine 2000 | Life technologies | 11668-07 | |
| Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector | Addgene | plasmid 21217 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | |
| Sodium bicarbonate | GibcoBRL | 11810-025 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 113375-100 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| NaOH | J.T. Bake | 3722-01 | |
| Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm | Millipore | SLHVM33RS | |
| Nikon TE2000E epifluorescence microscope | Nikon | TE2000E | |
| Cascade 1K CCD camera | Roper Scientific | ||
| NIS-Elements AR imaging software | Nikon | ||
| Nikon A1 confocal microscope | Nikon | A1 |
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