利用新的细胞分选策略, 从小鼠骨髓中生成大量的髓样祖细胞和树突状体细胞前体
Summary
在这里, 我们提供了一种方法, 以识别和隔离大量的 GM-脑脊液驱动髓细胞使用高速细胞排序。根据 Ly6C 和 CD115 的表达, 可以确定五种不同的种群 (常见髓样祖细胞、粒/巨噬细胞祖、单核细胞、单核细胞衍生巨噬细胞和单核细胞衍生的 DCs)。
Abstract
细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 在小鼠骨髓中产生的单核细胞来源的树突状体细胞 (moDC) 的培养最近被认为比以前所赞赏的多异质性。这些文化通常包含 moDC 和单核细胞衍生巨噬细胞 (moMac), 甚至一些较不发达的细胞, 如单核。本议定书的目标是提供一种一致的方法来识别和分离这些文化中存在的许多细胞类型, 以便它们的具体功能可以进一步研究。这里提出的分类策略将细胞先分为四种, Ly6C 和 CD115 的表达, 它们在转基因-脑脊液驱动的文化中发展的时候, 都是由细胞瞬时表达的。这四个种群包括普通髓样祖细胞或 CMP (Ly6C、CD115)、粒细胞/巨噬细胞祖或 GMP (Ly6C+、CD115)、单核细胞 (Ly6C+、CD115+) 和单核细胞衍生的巨噬菌或 moMac (Ly6C、CD115+)。CD11c 还添加到排序策略中, 以区分 Ly6C 中的两个种群, CD115-人口: CMP (CD11c) 和 moDC (CD11c+)。最后, 根据 MHC II. 类表达的水平, 在 Ly6C、CD115+ 人群中可以进一步区分两个种群。MoMacs 表达较低水平的 mhc ii 类, 而单核细胞衍生的 DC 前体 (moDP) 表达较高的 mhc ii. 类。这种方法可以可靠地隔离几个发育不同的种群, 这些数字足以用于各种功能和发展分析。我们强调一个这样的功能读数, 这些细胞类型的差异反应的刺激与病原体相关的分子模式 (PAMPs)。
Introduction
细胞因子-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 培养小鼠骨髓细胞的方法广泛应用于大数1的单核细胞衍生树突状细胞 (moDC; 也称为炎症 DC) , 2,3,4,5。这些细胞在树突状细胞 (DC) 功能6,7,8的各种研究中非常有用。通常, 这些小鼠骨髓细胞培养6-8 天, 然后用于研究树突状细胞功能5。这些文化长期被认为主要是同源的, 包括多数被区分的 moDC。最近, 很明显, 在这个6–8的天文化时期结束时, 确实有许多 moDC, 以及分化的单核细胞衍生巨噬细胞 (moMacs) 9,10,11的大子集。我们自己的研究进一步扩展了这些发现, 证明其他不发达细胞的子集, 如 moDC 前体 (moDP) 和单核, 在7天10的时间内仍然保持在低频率的文化中。因此, 利用这个系统产生的细胞来研究树突状细胞 (DC) 功能, 可以反映出比以前更广泛的细胞类型的反应。
我们从研究 GM-CSF 生成的 moDC 与这些细胞在分化的最后阶段12,13,14的功能上学到了很多。然而, 我们对这些细胞2、15、16的发展途径以及它们如何和何时表现出特定功能, 如: 对病原体相关分子的反应能力的了解明显较少。模式 (PAMPs), 吞噬功能, 抗原处理和表现13, 和抗菌活性。17报告了一项隔离大量常规 Flt3L-driven DC 祖和前体的议定书。利用羧基琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 染色的骨髓细胞 (在 Flt3L 中跟踪分裂细胞) 和培养3天, 实现了这些不同种群的分离。细胞被耗尽的宗族阳性细胞, 并排序为祖和前体群体的基础上 CD11c 表达17。Leenen 组在 GM-脑脊液驱动培养中识别 DC 早期祖细胞的另一种方法是根据 CD31 和 Ly6C 18对单元进行分类。最初的目标是建立一个类似的方法来获得 GM-脑脊液驱动 moDC 的祖和前体。由于由 GM-CSF 产生的特定细胞类型, 我们根据在早期和后期的发展阶段所表达的分子表达方式, 调整了方法和排序策略。我们最终确定 Ly6C、CD115 (CSF-1 受体) 和 CD11c 是区分这些细胞类型10的最佳标记。
在这里, 我们提出了一个方法, 在几个不同的发展阶段的细胞分离的途径, 由 GM-脑脊液: 普通髓样祖 (CMP), 粒细胞巨噬祖 (GMP), 单核细胞源性巨噬细胞(MoMac) 和单核细胞衍生 DC (MoDC)。moMac 种群可以根据 MHC II 类表达的水平进一步隔离, 揭示了 moDC 前体种群 (moDP) 10。我们利用一种高速荧光活化细胞分选 (Ly6C) 策略来隔离这5种群, 并以表达 CD115 和 CD11c 为基础。然后, 我们展示了这些细胞在功能检测中的检查, 揭示了它们对玉兰刺激的反应。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议促进了基因型脑脊液驱动的祖细胞和前体细胞类型的分离, 这些数字足以进行多种类型的分析, 包括生化化验、体外细胞功能的测定或体内灌注。这种方法代表单核细胞衍生的树突状细胞的发展, 使细胞在这一发展途径的早期可靠的分离和鉴定, 以及那些分化的细胞类型更常见的一个重要进展在先前的研究中被孤立。
以前的分离从骨髓中产生的祖细胞…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢在奥本大学兽医医学流式细胞仪设施的艾莉森教堂鸟的技术援助, 从 NIH 到 EHS R15 R15 AI107773, 以及在奥本大学的细胞和分子生物学项目的资助为夏季研究基金提供资金。
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
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