Generation af stort antal myeloide stamceller og dendritiske celle prækursorer fra Murine knoglemarven ved hjælp af en roman celle sortering strategi
Summary
Her giver vi en metode til at identificere og isolere stort antal GM-CSF drevet myeloide celler ved hjælp af højhastigheds celle sortering. Fem forskellige populationer (fælles myeloide stamceller, granulocyt-makrofag progenitorceller, monocytter, monocyt-afledte makrofager og monocyt-afledte DCs) kan identificeres baseret på Ly6C og CD115 udtryk.
Abstract
Kulturer af monocyt-afledte dendritiske celler (moDC) genereret fra mus knoglemarven ved hjælp af granulocyt-makrofag koloni stimulerende faktor (GM-CSF) har for nylig blevet anerkendt at være mere forskelligartede end tidligere værdsat. Disse kulturer indeholder rutinemæssigt moDC samt monocyt-afledte makrofager (moMac), og endda nogle mindre udviklede celler som monocytter. Målet med denne protokol er at skabe en konsekvent metode til identifikation og adskillelse af de mange celletyper i disse kulturer som de udvikler, således at deres særlige funktioner kan undersøges yderligere. Sortering strategien præsenteret her adskiller cellerne først i fire befolkning baseret på udtryk for Ly6C og CD115, som begge udtrykkes forbigående af celler som de udvikler i GM-CSF-drevet kultur. Disse fire populationer omfatter fælles myeloide stamceller eller CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyt-makrofag ophav eller GMP (Ly6C +, CD115-), monocytter (Ly6C +, CD115 +), og monocyt-afledte makrofager eller moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c er også tilføjet til sortering-strategien til at skelne mellem to befolkninger i Ly6C-, CD115-befolkning: CMP (CD11c-) og moDC (CD11c +). Endelig kan to populationer skelnes yderligere inden for Ly6C-, CD115 + befolkning baseret på niveauet af MHC klasse II udtryk. MoMacs express lavere niveauer af MHC klasse II, mens en monocyt-afledte DC forløber (moDP) udtrykker højere MHC klasse II. Denne metode giver mulighed for pålidelige isolering af flere udviklingshæmmede adskilte populationer i antal tilstrækkeligt til en lang række funktionelle og udviklingsmæssige analyser. Vi fremhæve én sådan funktionelle udlæsning, disse celletyper differential Reaktionerne stimulation med Pathogen-Associated molekylære mønstre (PAMPs).
Introduction
Dyrkning af murine knoglemarv celler med cytokin er granulocyt-makrofag koloni stimulerende faktor (GM-CSF) almindeligt anvendt som en metode til at generere monocyt-afledte dendritiske celler (moDC; også kendt som inflammatoriske DC) i stort tal 1, 2,3,4,5. Disse celler har været yderst nyttig i en række undersøgelser af dendritiske celler (DC) funktion 6,7,8. Typisk, disse murine knoglemarv celler er kulturperler i 6-8 dage og derefter anvendes til undersøgelse af dendritiske celle funktion 5. Disse kulturer havde længe været betragtet som for det meste homogen, bestående af et flertal af differentierede moDC. For nylig, er det blevet klart, at i slutningen af denne periode på 6 – 8 dage kultur, der er faktisk mange moDC, samt en stor delmængde af differentierede monocyt-afledte makrofager (moMacs) 9,10,11. Vores egne undersøgelser har yderligere udvidet disse resultater viser, at andre delmængder af mindre udviklede celler, såsom moDC prækursorer (moDP) og monocytter, forbliver i kulturer med lav frekvens selv efter 7 dage 10. Således, undersøgelser af dendritiske celler (DC) funktion ved hjælp af celler genereret af dette system kunne afspejle svar af en bredere kohorte af celletyper end tidligere værdsat.
Vi har lært en hel del fra studiet af GM-CSF-genereret moDC vedrørende funktionen af disse celler i de sidste faser af differentiering 12,13,14. Vi forstår dog væsentligt mindre om den udviklingsmæssige pathway af disse celler 2,15,16 , og af hvordan og hvornår de udviser specifikke funktioner som f.eks: lydhørhed over for patogenet associeret molekylære Mønstre (PAMPs), fagocytose, antigen behandling og præsentation 13og anti-bakteriel aktivitet. En protokol til isolering af store mængder af konventionelle Flt3L-drevet DC ophav og prækursorer er blevet rapporteret 17. Isolation af disse forskellige befolkninger blev opnået ved hjælp af carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-farves knoglemarv celler (for at spore delende celler) og kultur i Flt3L for 3 dage. Celler var så forarmet af linage positive celler og sorteret i Stamform og forløber befolkning baseret på CD11c udtryk 17. En anden tilgang af Leenens gruppe at identificere tidlige stamfaderen til DC i GM-CSF-drevet kultur var at sortere cellerne baseret på CD31 og Ly6C 18. Det oprindelige mål var at skabe en lignende metode til at indhente ophav og prækursorer af GM-CSF-drevet moDC. På grund af de specifikke celletyper genereret af GM-CSF, tilpasset vi tilgangen og sortering strategi baseret på udtryk for molekyler, der blev udtrykt i starten og senere faser af udvikling. Vi har i sidste ende besluttet, at Ly6C, CD115 (CSF-1 receptor), og CD11c var de bedste markører for skelne disse celle typer 10.
Vi præsenterer her, en metode til dyrkning af celler på flere forskellige stadier af udvikling langs vej af differentiering drevet af GM-CSF: fælles myeloide stamceller (CMP), granulocyt-makrofag stamfader (GMP), monocyt, monocyt-afledte makrofag (MoMac) og monocyt-afledte DC (MoDC). MoMac befolkningen kan være yderligere adskilte baseret på niveau af MHC klasse II udtryk, afslører en moDC forløber befolkning (moDP) 10. Vi udnytter en højhastigheds fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) strategi for at isolere disse 5 befolkning baseret på udtryk for Ly6C, CD115 og CD11c. Vi så vise, undersøgelse af disse celler i funktionelle assays afslører deres svar til PAMP stimulation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol letter dyrkning af GM-CSF-drevet Stamform og forløber celletyper i antal tilstrækkeligt for flere typer af analyser herunder biokemiske assays, assays af cellefunktion in vitroeller instillation in vivo. Denne metode repræsenterer et betydeligt fremskridt inden for monocyt-afledte dendritiske celle udvikling, således at pålidelige isolering og identifikation af celler tidligt i denne vej af udvikling samt de differentierede celletyper mere almindeligt isoleret i forudgående undersø…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for teknisk bistand fra Alison kirke fugl på Auburn University School af veterinærmedicin Flow flowcytometri anlægget, for midler fra NIH EHS R15 R15 AI107773 og cellulær og molekylærbiologi Program på Auburn University for sommeren forskningsmidler til PBR.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
