Generasjon av stort antall myelogen Progenitors og dendrittiske celle forløpere fra Murine benmarg bruker en roman celle sortering strategi
Summary
Her gir vi en metode for å identifisere og isolere stort antall GM-CSF drevet myeloide celler ved hjelp av høyhastighets celle sortering. Fem forskjellige populasjoner (felles myelogen progenitors, granulocytt/macrophage progenitors, monocytter, monocytt-avledet makrofager og monocytt-avledet DCs) kan identifiseres basert på Ly6C og CD115.
Abstract
Kulturer av monocytt-avledet dendrittiske celler (moDC) fra musen benmarg bruker granulocytt-Macrophage koloni stimulerende faktor (GM-CSF) har nylig blitt anerkjent å være mer sammensatt gruppe enn tidligere verdsatt. Disse kulturene inneholder rutinemessig moDC samt monocytt-avledet makrofager (moMac), og noen mindre utviklede celler som monocytter. Målet med denne protokollen er å gi en konsistent måte for identifikasjon og separasjon av mange celletyper tilstede i disse kulturene som de utvikler, slik at deres spesifikke funksjoner kan utredes videre. Sortering strategien presenteres her skiller celler først i fire populasjonene basert på uttrykk for Ly6C og CD115, begge er uttrykt transiently av celler som de utvikler i GM-CSF drevet kultur. Disse fire populasjoner inkluderer felles myelogen progenitors eller CMP (Ly6C-, CD115-), granulocytt/macrophage progenitors eller GMP (Ly6C +, CD115-), monocytter (Ly6C +, CD115 +), og monocytt-avledet makrofager eller moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c legges også til sortering strategien å skille to bestander i Ly6C-, CD115-befolkningen: CMP (CD11c-) og moDC (CD11c +). Endelig, to bestander kan videre skilles i Ly6C-, CD115 + populasjon, basert på nivået av MHC, klasse II uttrykk. MoMacs express lavere nivåer av MHC, klasse II, mens en monocytt-avledet DC forløper (moDP) uttrykker høyere MHC, klasse II. Denne metoden gir pålitelige isolasjon av flere developmentally forskjellige populasjoner i antall tilstrekkelig for en rekke funksjonelle og utviklingsmessige analyser. Vi markere en slik funksjonelle avlesning, differensial svar disse celletyper stimulering med Pathogen-Associated molekylær mønster (PAMPs).
Introduction
Dyrking murine beinmargen celleområde med cytokin er granulocytt-Macrophage koloni stimulerende faktor (GM-CSF) mye brukt som en metode til å generere monocytt-avledet dendrittiske celler (moDC, også kjent som inflammatorisk DC) i store tall 1, 2,3,4,5. Disse cellene har vært svært nyttig i en rekke studier av dendrittiske celle (DC) funksjonen 6,7,8. Vanligvis disse murine benmarg cellene er kultivert for 6-8 dager og deretter brukes for studiet av dendrittiske celle funksjon 5. Disse kulturene hadde lenge vært ansett som hovedsakelig homogen, bestående av et flertall av forskjellige moDC. Flere nylig, har det blitt klart at på slutten av denne 6 – 8 dagersperioden kultur, det er faktisk mange moDC, i tillegg til store delsett med differensiert monocytt-avledet makrofager (moMacs) 9,10,11. Våre egne studier har ytterligere utvidet disse funnene viser at andre delsett av mindre utviklede celler, for eksempel moDC prekursorer (moDP) og monocytter, forblir i kulturer på lav frekvens selv etter 7 dager 10. Dermed kan studier dendrittiske celler (DC) funksjon med celler generert av dette systemet reflektere svarene på en bredere kohort celletyper enn tidligere verdsatt.
Vi har lært mye fra studiet av GM-CSF-generert moDC knyttet til funksjonen i disse cellene i sluttfasen av differensiering 12,13,14. Men vi forstår betydelig mindre om utviklingsmessige veien av disse cellene 2,15,16 og av hvordan og når de viser bestemte funksjoner som: respons til patogen-forbundet molekylær Mønster (PAMPs), fagocytose, antigen prosessering og presentasjon 13og antibakteriell aktivitet. En protokoll for isolering av store antall konvensjonelle Flt3L-drevet DC progenitors og prekursorer er rapportert 17. Isolasjon av disse forskjellige befolkningsgrupper var oppnådd, med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-farget bein margtransplantasjon celler (for å spore dele celler) og kultur i Flt3L i 3 dager. Cellene ble deretter utarmet av linage positiv celler og sortert i stamfar og forløper populasjonene basert på CD11c uttrykk 17. En annen tilnærming av Leenens gruppe å identifisere tidlig progenitors av DC i GM-CSF drevet kultur var sortere cellene basert på CD31 og Ly6C 18. Det opprinnelige målet var å skape en lignende metode progenitors og forløpere for GM-CSF-drevet moDC. På grunn av de spesifikke celletyper generert av GM-CSF, tilpasset vi tilnærming og sortering strategi basert på uttrykk for molekyler som ble uttrykt i tidlig og senere stadier av utviklingen. Vi til slutt bestemte at Ly6C, CD115 (CSF-1 reseptor), og CD11c var den beste markører for skille disse cellen typer 10.
Her presenterer vi en metode for isolering av celler på flere forskjellige stadier av utviklingen langs veien av differensiering drevet av GM-CSF: felles Myeloid Progenitor (CMP), granulocytt-Macrophage stamfar (GMP), monocyte, monocytt-avledet Macrophage (MoMac) og monocytt-avledet DC (MoDC). MoMac befolkningen kan videre segregerte basert på nivå av MHC, klasse II uttrykk, får en moDC forløper befolkningen (moDP) 10. Vi benytter en høyhastighets fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) strategi for å isolere disse 5 populasjonene basert på uttrykk for Ly6C, CD115 og CD11c. Deretter viser vi undersøkelse av disse cellene i funksjonelle analyser avsløre sine svar til PAMP stimulering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen forenkler isolering av GM-CSF-drevet stamfar og forløper celletyper i antall tilstrekkelig for flere typer analyser inkludert biokjemiske analyser, analyser av cellulære funksjoner i vitroeller instillasjon i vivo. Denne metoden representerer en betydelig fordel innen monocytt-avledet dendrittiske celle utvikling, aktiverer pålitelige isolasjon og identifikasjon av celler tidlig i denne veien av utvikling, samt de forskjellige celletyper oftere isolert i tidligere studier.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for teknisk assistanse fra Alison kirken fugl på Auburn University skolen av Veterinary medisin Flow cytometri anlegget, om finansiering fra NIH EHS R15 R15 AI107773 og Cellular og molekylærbiologi programmet ved Auburn University for sommeren forskningsmidler til PBR.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
