Generation av stort antal myeloida och dendritiska cellen prekursorer från murina benmärg med en roman Cell sortering strategi
Summary
Här tillhandahåller vi en metod för att identifiera och isolera stort antal GM-CSF driven myeloida celler med hög hastighet cell sortering. Fem distinkta populationer (gemensamma myeloida, granulocyt/makrofag stamfäder, monocyter, monocyt-derived makrofager och monocyt-derived DCs) kan identifieras baserat på Ly6C och CD115 uttryck.
Abstract
Kulturer av monocyt-derived dendritiska celler (moDC) genereras från mus benmärg med granulocyt-makrofag koloni stimulerande faktor (GM-CSF) har nyligen erkänts vara mer heterogen än tidigare uppskattat. Dessa kulturer innehåller rutinmässigt moDC samt monocyt-derived makrofager (moMac) och även några mindre utvecklade celler såsom monocyter. Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en konsekvent metod för identifiering och separation av de många celltyper som förekommer i dessa kulturer som de framkallar, så att deras specifika funktioner kan undersökas vidare. Sortering strategin presenteras här separerar celler först till fyra populationer baserat på uttryck för Ly6C och CD115, som båda uttrycks normalnivå av celler eftersom de utvecklas i GM-CSF-driven kultur. Dessa fyra populationer inkluderar gemensamma myeloida eller CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyt/makrofag föräldraparets eller GMP (Ly6C +, CD115-), monocyter (Ly6C +, CD115 +), och monocyt-derived makrofager eller moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c läggs också till sortering strategin för att skilja två populationer inom Ly6C-, CD115-befolkning: CMP (CD11c-) och moDC (CD11c +). Slutligen kan två populationer särskiljas ytterligare inom Ly6C-, CD115 + population baserad på jämnt av MHC klass II uttryck. MoMacs express lägre nivåer av MHC klass II, medan en monocyt-derived DC föregångare (moDP) uttrycker högre MHC klass II. Denna metod tillåter för tillförlitlig isolering av flera utvecklingsmässigt distinkta populationer i nummer tillräckligt för en mängd funktionella och utvecklingsmässiga analyser. Vi lyfta fram en sådan funktionell avläsning, differentiell svaren från dessa celltyper att stimulering med Pathogen-Associated molekylära mönster (PAMPs).
Introduction
Odling av murina benmärgsceller med cytokin används granulocyt-makrofag koloni stimulerande faktor (GM-CSF) allmänt som en metod för att generera monocyt-derived dendritiska celler (moDC; även känd som inflammatoriska DC) i stora antal 1, 2,3,4,5. Dessa celler har varit extremt användbar i en mängd studier av dendritiska cellen (DC) funktion 6,7,8. Normalt dessa murina benmärgsceller finns odlade för 6-8 dagar och sedan används för studier av dendritiska cellen funktion 5. Dessa kulturer hade länge ansetts mest homogen, bestående av en majoritet av differentierade moDC. Mer nyligen, har det blivit tydligt att i slutet av denna period med 6 – 8 dagar i kultur, det finns verkligen många moDC, liksom en stor delmängd av differentierade monocyt-derived makrofager (moMacs) 9,10,11. Våra egna studier har ytterligare dessa fynd visar att andra grupper av mindre utvecklade celler, såsom moDC prekursorer (moDP) och monocyter, förbli i kulturer på låg frekvens även efter 7 dagar 10. Studier av dendritiska celler (DC) funktion som använder celler som genereras av detta system kan således spegla svaren från en bredare kohort av celltyper än tidigare uppskattat.
Vi har lärt oss en hel del från studien av GM-CSF-genererade moDC avser funktionen av dessa celler i slutskedet av differentiering 12,13,14. Vi förstår emellertid betydligt mindre om utvecklingstoxicitet vägen av dessa celler 2,15,16 och av hur och när de uppvisar specifika funktioner såsom: lyhördhet för patogener associerade molekylära Mönster (PAMPs), fagocytos, antigen bearbetning och presentation 13och antibakteriell aktivitet. Ett protokoll för isolering av stort antal konventionella Flt3L-driven DC stamfäder och prekursorer har varit rapporterade 17. Isolering av dessa distinkta populationer uppnås med hjälp av carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-målat benmärgsceller (för att spåra delande celler) och kultur i Flt3L i 3 dagar. Cellerna var sedan utarmat radantal positiva celler och sorteras till stamceller och föregångaren populationer utifrån CD11c uttryck 17. En annan metod av Leenens grupp att identifiera tidiga stamfäder för DC i GM-CSF-driven kultur var att sortera celler baserat på CD31 och Ly6C 18. Det ursprungliga målet var att skapa en liknande metod för att erhålla stamfäder och prekursorer av GM-CSF-driven moDC. På grund av de specifika celltyper som genereras av GM-CSF, anpassat vi metoden och sortering strategi baserad på uttryck för molekyler som uttrycktes i början och senare stadier av utveckling. Vi slutligen fastställt att Ly6C, CD115 (CSF-1-receptorn), och CD11c var bästa markörerna för särskilja dessa cell typer 10.
Här presenterar vi en metod för isolering av celler på flera olika faser av utvecklingen längs vägen av differentiering drivs av GM-CSF: gemensamma myeloida stamceller (CMP), granulocyt-makrofag stamceller (GMP), monocyt, monocyt-derived makrofag (MoMac) och monocyt-derived DC (MoDC). MoMac befolkningen kan ytterligare uppdelas baserat på nivå av MHC klass II uttryck, avslöjar en moDC föregångare befolkningen (moDP) 10. Vi använder en höghastighets fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) strategi för att isolera dessa 5 populationer baserat på uttryck för Ly6C, CD115 och CD11c. Vi visar då prövningen av dessa celler i funktionella analyser avslöjar sina svar till PAMP stimulering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll underlättar isolering av GM-CSF-driven stamceller och föregångaren celltyper i siffror räcker för flera typer av analyser inklusive biokemiska analyser, analyser av cellulär funktion in vitroeller instillation i vivo. Denna metod innebär ett betydande framsteg i fältet monocyt-derived dendritiska cellen utveckling, möjliggör tillförlitlig isolering och identifiering av celler tidigt i denna väg av utveckling samt de differentierade celltyper oftare isolerade i tidigare studie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för tekniskt bistånd från Alison kyrkan fågel på Auburn University School av veterinärmedicin Flow flödescytometri anläggningen, för finansiering från NIH att EHS R15 R15 AI107773 och cellulär och molekylärbiologi Program vid Auburn University för sommaren forskningsfinansiering att PBR.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
