Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte
Summary
Zebrafish têm sido usados como organismos modelo genético confiável na investigação biomédica, especialmente com o advento das tecnologias de edição de gene. Quando os fenótipos larvas são esperados, identificação de DNA de extração e genótipo pode ser desafiador. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente de genotipagem para larvas de peixe-zebra, por cauda de recorte, tão cedo quanto pós-fertilização 72-h.
Abstract
Peixe-zebra (Danio rerio) possuem orthologues para 84% dos genes conhecidos por serem associados com doenças humanas. Além disso, estes animais têm um tempo de geração curto, são fáceis de manipular, exibir uma alta taxa de reprodução, baixo custo e são facilmente passíveis de manipulações genéticas por microinjeção de DNA em embriões. Avanços recentes no gene ferramentas de edição estão permitindo introdução precisa de mutações e de transgenes no zebrafish. Doença de modelagem no zebrafish frequentemente leva a fenótipos larvas e morte prematura, que pode ser um desafio para interpretar se genótipos são desconhecidos. Esta identificação precoce de genótipos é também necessário em experimentos que requerem pooling de amostra, tal como em estudos de espectrometria de expressão ou massa de gene. No entanto, extensa seleção genotípica é limitada pelos métodos tradicionais, que na maioria dos laboratórios são realizados somente em zebrafish adulto ou em larvas pós-morte. Resolvemos este problema, adaptando um método para o isolamento do DNA genômico de PCR-pronto de larvas de zebrafish ao vivo que pode ser alcançado logo em fertilização pós de 72 h (hpf). Desta vez e cost-effective técnica, melhorado a partir de um protocolo de genotipagem publicado anteriormente, permite a identificação de genótipos de biópsias de barbatana microscópica. As barbatanas regeneram rapidamente como as larvas se desenvolvem. Pesquisadores podem então selecionar e elevar os genótipos desejados para a vida adulta, utilizando este procedimento baseados em PCR genotipagem elevado-throughput.
Introduction
O peixe-zebra (Danio rerio) é um organismo de vertebrados amplamente utilizado como um modelo para investigação de doença, bem como para testes pré-clínicos de hipóteses terapêuticas1,2,3. Estes animais têm um tempo de geração curto, são fáceis de manipular, exibir uma alta taxa de reprodução, baixo custo e são facilmente passíveis de manipulações genéticas por microinjeção de DNA em embriões4. Através do crescente desenvolvimento do romance transgénico e gene edição tecnologias como zinco-dedo nucleases (ZFN)5, TAL como efetoras Nucleases (TALENs)6,7e o cluster regularmente intercaladas curto Palindromic repete (CRISPR) / CRISPR-associado 9 (Cas9) sistema8, o zebrafish está prestes a melhorar substancialmente a compreensão das várias condições patológicas. Essas tecnologias têm sido utilizadas para criar alvo nocautes em ambos somáticas e células da linha germinal no zebrafish, eficientemente, engendrando geneticamente modificado animais8. Exemplos recentes na literatura incluem o desenvolvimento bem sucedido de modelos genéticos de epilepsia e distúrbios metabólicos no zebrafish3,9,10,11,12 .
Com os progressos alcançados na edição de genoma de zebrafish, rápida e confiável de genotipagem tornou-se um inegável passo limitante. Identificação de mutações específicas de DNA adjacentes ao local de destino do genoma-edição prevista é uma etapa essencial do protocolo. Tradicionalmente, técnicas de genotipagem por recorte de barbatana são geralmente apenas realizada no zebrafish juvenil ou adulto. No entanto, o tempo gasto zebrafish levantando até a idade adulta (> 2 meses) atrasa consideravelmente os avanços na pesquisa. Em muitos casos, à idade adulta não pode ser realizada devido o nocaute de genes essenciais (por exemplo, na modelagem de doença) ou mutações de ganho-de-função, levando a efeitos fenotípicos prejudiciais. Além disso, vários ensaios exigem a conjugação de larvas, como na extração de RNA ou metabólito e, portanto, envolvem a prévia identificação de genótipos, que pode ser um desafio quando único post hoc técnicas de genotipagem estão disponíveis. Estes exemplos acima mencionados realçar a importância das técnicas de genotipagem larval que são ao mesmo tempo preciso e permitem a recuperação completa e normal desenvolvimento das larvas. Genotipagem de zebrafish fase precoce atualmente parece não ser amplamente utilizado; Isto é refletido por publicações recentes de modelos de doenças em que larval genótipos são identificados através de post-mortem genotipagem, ao invés de genotipagem antes da realização do experimento12,13,14. Neste trabalho, uma estratégia de clip de barbatana larval é apresentada com o objetivo de melhorar os procedimentos de genotipagem previamente estabelecidas.
No passado, estratégias empregando digestão de proteinase K ao genótipo live zebrafish larvas conduziram a polimerase variável de eficiência de reação em cadeia (PCR)15. Embora mais recentemente publicou a técnica de biópsia microscópica cauda fornecida mais promissores resultados16, nós e outros grupos não foram capazes de reproduzir a alta eficiência e recuperação do DNA relatado pelos autores. Um grande revés do protocolo descrito por Wilkinson et al . 16 pode ser a transferência do tecido cauda para o tubo do PCR. Devido ao seu tamanho microscópico, é difícil garantir que a barbatana foi devidamente recolhida e dispensada por pipetagem. Para resolver esta barreira, nós desenvolvemos um protocolo melhorado para grandes números de genotipagem de larvas de zebrafish ao vivo com quase 100% de eficiência de9. Usando um microscalpel, a ponta da cauda a nadadeira é removida e colocada em um pedaço de papel de filtro. O pedaço de papel de filtro contendo o tecido pode ser facilmente visualizado e correctamente colocado em um tubo PCR. Extração de DNA genômica é executada em seguida, seguido de amplificação por PCR da região de interesse para o genótipo a amostra. As vantagens deste método incluem uma alta eficiência do PCR, uma baixa taxa de falsos positivos e uma taxa de mortalidade baixa. Além disso, a genotipagem de um grande número de embriões é possível usando este protocolo. O protocolo descrito neste documento permite barbatana-recorte de centenas de larvas dentro de 2-3 h usando esta abordagem e a correcta identificação dos peixes do genótipo e cauda regeneração dentro de dois dias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gene, ferramentas de edição têm sido empregadas precisamente introduzir mutações e transgenes no zebrafish ao longo dos últimos anos5,6,7,8. Ao executar a doença modelagem no zebrafish, cedo fenótipos larvais ou juvenis são frequentemente observados9,12,13,14…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer aos modelos de doença rara e rede de mecanismo (RDMM) (financiado pelos institutos canadenses da pesquisa saúde (CIHR) e Canadá genoma). CK é suportado por um prêmio de bolsa UROP (Universidade de Ottawa). DLJ é apoiado por uma bolsa de pós-graduação de Canadá Vanier. IAP é suportado por um prêmio de pós-doutorado de institutos canadenses da pesquisa saúde (CIHR). Os autores agradecer o Genetics Society of America para a concessão de permissão para publicar este protocolo e usar uma adaptação da Figura 5 suplementar de Pena, et al.
Materials
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
