Summary
Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.
Abstract
Zebrafish (Danio rerio) bezitten orthologues voor 84% van de genen geassocieerd te worden met ziekten bij de mens bekend. Bovendien, deze dieren hebben een korte generatietijd, zijn eenvoudig te verwerken, weer een reproductieve hoog, lage kosten, en zijn gemakkelijk vatbaar voor genetische manipulaties door microinjection van DNA in embryo's. Recente vooruitgang in gen bewerkingsgereedschappen zijn precieze invoering van mutaties en transgenen in zebrafish inschakelen. Ziekte modelleren in zebrafish vaak leidt tot larvale fenotypes en vroege dood die kan lastig zijn om te interpreteren als genotypen onbekend zijn. Deze vroege identificatie van genotypen is ook nodig in experimenten waarbij monster bundelen, zoals gen expressie of massa spectrometrie studies. Uitgebreide genotypische screening wordt echter beperkt door traditionele methoden, die in de meeste laboratoria alleen op volwassen zebrafish of in postmortem larven worden uitgevoerd. We hebben behandeld dit probleem door aanpassing van een methode voor de isolatie van de genomic DNA PCR-klaar uit levende zebrafish larven die zo spoedig 72 h na bevruchting (hpf) kan worden bereikt. Deze tijd en de rendabele techniek, verbeterd ten opzichte van een eerder gepubliceerde genotypering-protocol, kunt de identificatie van genotypen van microscopische fin biopsieën. De vinnen regenereren snel naarmate de larven zich ontwikkelen. Onderzoekers kunnen vervolgens te selecteren en de gewenste genotypen naar volwassenheid verhogen door gebruik te maken van deze high-throughput genotypering PCR-gebaseerde procedure.
Introduction
De zebravis (Danio rerio) is een gewervelde organisme gebruikte als een model voor onderzoek van de ziekte zo goed als voor preklinische testen van therapeutische hypothesen1,2,3. Deze dieren hebben een korte generatietijd, zijn eenvoudig te verwerken, weer een reproductieve hoog, lage kosten, en zijn gemakkelijk vatbaar voor genetische manipulaties door microinjection van DNA in embryo's4. Door de toenemende ontwikkeling van transgene roman en gene technologieën zoals zink-vinger nucleasen (ZFN)5TAL-achtige Effector nucleasen (TALENs)6,7en de geclusterde regelmatig Interspaced korte bewerken Palindromische herhaalt (CRISPR) / CRISPR-geassocieerde 9 (Cas9) systeem8, de zebravis is klaar om een aanzienlijke verbetering van het inzicht van verscheidene pathologische voorwaarden. Deze technologieën zijn gebruikt voor het maken van gerichte uitsparingen in zowel somatische en germline cellen in zebrafish, efficiënt teweegbrengt genetisch gemodificeerde dieren8. Recente voorbeelden in de literatuur zijn de succesvolle ontwikkeling van genetische modellen van epilepsie en metabole aandoeningen in zebrafish3,9,10,11,12 .
Met de vooruitgang die is geboekt in de zebravis genoom bewerken, snelle en betrouwbare genotypering uitgegroeid tot een onmiskenbare snelheidslimieten stap. Identificatie van specifieke DNA-mutaties, grenzend aan de voorspelde genoom-bewerken doelsite is een essentiële fase van het protocol. Traditioneel zijn genotypering technieken door fin knippen meestal alleen uitgevoerd in jonge of volwassen zebrafish. Echter, de tijd doorgebracht verhogen zebrafish naar volwassenheid (> 2 maanden) vertragingen aanzienlijk vooruitgang in onderzoek. In veel gevallen zijn volwassenheid niet haalbaar als gevolg van het knockout van essentiële genen (bijvoorbeeld in ziekte modellering) of winst-van-functie mutaties leidt tot fenotypische schadelijk. Bovendien verschillende tests vereisen bundeling van larven, zoals de extractie van RNA of metaboliet, en dus het betrekken van eerdere behoefteanalyses van de genotypes, die kan lastig zijn wanneer slechts post hoc genotypering technieken beschikbaar zijn. Deze bovengenoemde voorbeelden wijzen op het belang van larvale genotypering technieken die tegelijkertijd nauwkeurig en volledig herstel en normale ontwikkeling van het larven inschakelen. Vroege fase zebrafish genotypering momenteel niet op grote schaal worden gebruikt; Dit wordt weerspiegeld door recente publicaties van ziekte modellen waarin larvale genotypen zijn geïdentificeerd met behulp van post mortem genotypering in plaats van genotypering voorafgaande aan de uitvoering van het experiment12,13,14. In deze paper wordt een larvale fin clip strategie gepresenteerd ter verbetering van tevoren vastgelegde genotypering procedures.
In het verleden leven strategieën dienst proteïnase K spijsvertering aan genotype zebrafish larven hebben geleid tot variabele polymerase kettingreactie (PCR) efficiëntie15. Hoewel een meer onlangs gepubliceerd microscopische staart biopsie techniek verstrekt meer belovende resultaten16, waren wij en andere groepen niet in staat om de hoge efficiëntie en DNA herstel gemeld door de auteurs te reproduceren. Een grote tegenslag voor het protocol beschreven door Wilkinson et al. 16 zou de overdracht van het weefsel van de staart aan de PCR-buis. Als gevolg van de microscopische grootte is het moeilijk om ervoor te zorgen dat de fin is behoorlijk opgehaald en afgeleverd door pipetteren. Om deze barrière, hebben we een verbeterde protocol voor genotypering grote aantallen levende zebrafish larven met bijna 100% rendement9ontwikkeld. Met behulp van een microscalpel, is het puntje van de staart van de fin verwijderd en op een stuk papier van de filter geplaatst. Het stuk filtreerpapier met het weefsel kan worden gemakkelijk gevisualiseerd en correct geplaatst in een PCR-buis. Genomic DNA-extractie wordt vervolgens uitgevoerd, gevolgd door PCR versterking van de regio van belang naar genotype het model. De voordelen van deze methode zijn een hoog rendement van PCR, een laag valse positieve tarief en een laag sterftecijfer. Bovendien is genotypering van grote aantallen embryo's mogelijk met behulp van dit protocol. Het protocol hierin beschreven kunt fin-knippen van honderden larven binnen 2-3 uur met behulp van deze aanpak en een correcte identificatie van gegenotypeerde vis en staart regeneratie binnen twee dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd en zijn overeenkomstig de richtsnoeren van de verzorging van de dieren die door de Canadese Raad op Animal Care en de Universiteit van Ottawa dierenverzorgers commissies.
1. voorbereiding
- Prepareer het oppervlak van de dissectie door taping een 9 cm petrischaal deksel met autoclaaf tape over de binnenkant. Plaats deze onder een stereomicroscoop.
- Plaats van 3-5 dagen na bevruchting (dpf) zebrafish larven in een Petri schotel en anesthetize in ˜1.5 mM tricaïne in 1 x E3 embryo media (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, pH 7,2).
- Het einde van een P1000 pipette uiteinde met een paar van schaar of een scheermesje afgesneden met een diameter van 2 mm voor een 3 dpf larve met minimale stress.
2. de fin knippen van zebravis larven
- Pak een narcose larve met behulp van de gewijzigde P1000 micropipet en plaatsen van de larve van de zebravis op een geplaatste autoclaaf tape op het deksel van de petrischaal.
- Verwijder overtollige tricaïne oplossing rond de larve die met behulp van een micropipet. Het gebied moet zo droog mogelijk met succes afdeling en ophalen van de fin maar nog nat om overleving.
- Met behulp van een micro scalpel, sectie de caudal fin onder een stereomicroscoop zoals aangegeven in Figuur 1, zoals beschreven in Wilkinson et al.16. Tijdens de insnijding van een gestage neerwaartse druk binnen de site van de kloof pigment van de caudal fin, distale op de grens van de bloedsomloop (figuur 1A) van toepassing. Zachte druk om te voorkomen beschadiging van de chorda van toepassing.
- Visualiseer de verdeelde fin onder de loep en plaatst het stuk op de top van het uiteinde van het microscalpel blad (figuur 2A). Plaats de microscalpel met van de vin op het oppervlak van een klein stukje filtreerpapier.
Opmerking: Als gevolg van de aanwezigheid van melanocyten in de transected weefsel, deze stap maakt het mogelijk de visualisatie van de fin als een kleine zwarte vlek (figuur 2B). - Met behulp van schaar en pincet (figuur 2C), overdracht het filtreerpapier met de vin aan een 96-Wells PCR plaat, met 25 μL van 50 mM NaOH oplossing per putje (figuur 2D).
- Voorbereiden van een flat-96-Wells bodemplaat, nummering van de put volgens het etiket van de PCR-plaat. Met behulp van de gewijzigde P1000 pipet gevuld met 200 µL van vers 1 x E3 embryo media, zorgvuldig verzamelen de larve van de zebravis met zachte druk. Afzien van de larve in de weefselkweek 96-wells-plaat, in hetzelfde goed nummer als de PCR-plaat (figuur 2E).
- Zorg ervoor dat het koffiefilter is goed ondergedompeld in de oplossing (figuur 2F). Reinig het mes van de microscapel en pincet tussen elke snede ter voorkoming van kruisbesmetting door dompelen het in 70% EtOH oplossing. Veeg het mes met schone papier weefsel/doekje.
- Herhaal stap 2.1-2.7 totdat alle embryo's hebben zijn afgekapt.
- Bewaar de larven in de 96-wells-plaat bij 28 ° C totdat de genotypen hebben geïdentificeerd.
Opmerking: De embryo media hoeft niet te worden gewijzigd, aangezien het protocol kan gemakkelijk worden afgerond in minder dan 2 dagen. Als meer tijd nodig is, is het raadzaam een verandering van de media.
3. genomic DNA-extractie
- Het zegel van de 96-Wells PCR plaat en centrifuge de monsters bij 1.000 x g gedurende 1 minuut om ervoor te zorgen dat alle papieren van de filters zijn ondergedompeld in de NaOH-oplossing.
- Warmte voor lysis van de weefsels, de monsters in een thermocycler bij 95 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door afkoeling tot 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Voeg 6 l 500 mM Tris-HCl, pH 8,0 aan elk monster. Vortex.
- Kort centrifugeren de plaat bij 1.500 x g, gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Gebruik 1.5 μL van de bovendrijvende substantie van DNA per PCR-reactie.
- De voorbereiding van een PCR te genotype de larven, zoals weergegeven in tabel 1-2.
Opmerking: Dit protocol werd getest voor twee toepassingen: multiplex PCR reacties onthullen het genotype met agarose gel9en heteroduplex smelten assay (HMA) onthullen de genotypen met behulp van polyacrylamide-gel elektroforese (pagina)17.
4. alternatieve Genomic extractie met behulp van een chelaatvormers hars
- Volledige stap 2.5 door filtreerpapier met de geknipte fin toe te voegen aan een 96-Wells PCR plaat, met 30 μL van 5% chelaat hars (met gekoppelde iminodiacetate ionen copolymeer van styreen-divinylbenzeen).
Opmerking: Dit soort hars wordt vaak gebruikt voor lysis van de weefsel en voorbereiding van gebruiksklaar voor PCR DNA in een snelle en efficiënte wijze18. - Stappen 2.6-2.8 zoals aangegeven.
- Zegel van de 96-Wells PCR plaat en kort centrifugeren van de monsters moet ervoor zorgen dat alle filterpapier wordt ondergedompeld in de chelaatvormers hars.
- Warmte voor lysis van de weefsels, de monsters in een thermocycler bij 95 ° C gedurende 15 minuten gevolgd door afkoeling tot 4 ° C gedurende 10 minuten.
Opmerking: Deze stap maakt het mogelijk lysis en de daaropvolgende binding van de polar harsparels naar cellulaire componenten terwijl DNA en RNA in oplossing blijven. - Kort centrifugeren de monsters de harsparels pellet te verkrijgen van het DNA in de opschorting.
- Stappen 3.5-3.6 genotypering procedure wilt uitvoeren.
5. toepassing 1: Multiplex PCR, gevolgd door analyse van het Agarose Gel
- Tabel 1, stellen een multiplex PCR-reactie om de discriminatie tussen homozygoot mutanten, heterozygoten en WT larven. Gebruik een 96-Wells thermische cycler om uit te voeren van de PCR reacties met behulp van de fietsen voorwaarden beschreven in tabel 3.
Opmerking: De PCR reacties kunnen ook worden uitgevoerd in elke andere conventionele PCR thermische cycler. In het volgende voorbeeld beschrijft de strategie van de PCR gebruikt door Pena, et al.. 9 om aldh7a1 WT en de mutant allelen 5-bp invoeging in dezelfde multiplex reactie te identificeren. - Bereiden van een 1% agarose gel in natriumboraat buffer, gekleurd met 1 x GelRed.
Opmerking: 20 x natriumboraat buffervoorraad is gemaakt van 40 mL 10 M NaOH, 1800 mL ddH2O, pH aangepast tot 8,5 met 76 g boorzuur en vervolgens afgerond op 2 L eindvolume met behulp van ddH2O. - De gel in 1 x natriumboraat buffer voor 15 min op 250 V worden uitgevoerd. De om proces te vergemakkelijken, indien mogelijk, gebruik een gel systeem dat compatibel is met meerdere kanalen pipets om hogere doorvoer mogelijkheden door het verminderen van de tijd om te laden van monsters.
- Het imago van de gel onder ultraviolet (UV)-licht dat discriminatie van de verschillende genotypen.
6. toepassing 2: Heteroduplex Assay smelten
- Bereiden pagina 12% gels met behulp van de plaat van 1,5 mm spacer en de 15-monsters kammen. Bereiden van twee pagina gelen met behulp van 12.21 mL van ddH2O, 2,52 mL van 10 x 10 mL van 30% acrylamide, Tris/boraat/EDTA (FSME), 250 μL van 10% ammoniumnitraat persulfate (APS) en 20 μL van tetramethylethylenediamine (TEMED). 1 x TBE buffer gebruiken (0.089 M Tris-HCl, 0.089 M boorzuur en 0,002 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)) als het uitvoeren van de buffer.
- Verwarm de PCR producten bij 94 ° C gedurende 5 min.
- Koel de buizen op ijs of in de thermocycler gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- 10 μL per PCR monster en 8 μL van moleculair gewicht marker laden.
- De pagina uitvoeren bij 150 V in 1 x TBE met behulp van een verticale elektroforese systeem voor 1 uur of totdat de markering molecuulgewicht bijna bereikt de lijn van de voet van de glasplaat.
- Het imago van de gel onder UV-licht dat discriminatie van de verschillende genotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De efficiëntie van de protocoll werd aangetoond door genotypering de nakomelingen van een heterozygoot Kruis (aldh7a1+/ ot100, hier weergegeven als aldh7a1+/-) ()figuur 3A- C)9. De mutant aldh7a1ot100-allel heeft een 5-basenpaar (bp) inbrengen in de eerste codering exon van de zebravis aldh7a1 gen die tot frameshift en verlies-van-functie als gevolg van een vroege stop codon9 leidt. Vier inleidingen werden gebruikt in een multiplex reactie te verkrijgen van de drie onderscheidende banden om te differentiëren tussen WT heterozygoot (aldh7a1+/-) en homozygoot mutant (aldh7a1- / -) genotypen (van Pena, et al. 9): Gen1_FW 5'-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3 ","Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3", "5 nt-ins-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3 ", en"WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'). De versterking van beide allelen met behulp van de Gen1_FW en Gen1_RV inleidingen resulteerde in een 434-bp amplicon. Een 293-bp-band ontstaan uit specifieke versterking van de mutant allel en een band 195-bp was verkregen specifiek voor de WT-allel, zoals weergegeven in figuur 3A. Na PCR, 8 µL van elk 20 µL reactie volume werd geanalyseerd op een 1% agarose/natrium boraat gel, zoals weergegeven in figuur 3B. Voldoende larvale DNA werd teruggevonden van 98% (n = 576) van de monsters, wat resulteert in een hoog van de PCR-efficiëntie. DNA-extractie met behulp van de NaOH techniek haalt gemiddeld 4,7 0,5 ng/µL van larvale DNA per steekproef na de fin biopsie procedure, ~ 30 µL volume. DNA-extractie met behulp van de chelaatvormers hars resulteert in een vergelijkbaar rendement, gemiddeld 3.8 0,5 ng/µL van DNA per steekproef. Deze hoeveelheid DNA verzameld van larvale fin transections genereert de genomic DNA van de PCR-klaar van voldoende kwaliteit te maken voor de identificatie van genotypen. Elke DNA-monster kan worden gebruikt in ˜30 PCR versterking reacties. Versterking producten verkregen met behulp van primers, Gen1_FW en Gen2_RV kunnen ook worden gebruikt voor sequencing toepassingen9, die met succes de 5-bp-invoeging in de homozygoot mutanten (aldh7a1- / -) (Figuur 3 c ). Sanger sequencing werd uitgevoerd via een externe dienst om te testen of de PCR-producten geschikt voor deze toepassing zijn. DNA-monsters uit agarose-gel bevestigd homozygoot mutanten en WTs (n = 3, elke) werden gebruikt. Topscores voor Phred19 (> 30) werden verkregen met vermelding van hoge kwaliteit leest, met uitzondering van de eerste en de laatste 40 basenparen.
Dit protocol werd vervolgens gebruikt om genotype verschillende andere zebrafish mutaties door heteroduplex analyse smelten. De plpbpot101 en plpbpot102 mutant allelen van het plpbp gen (figuur 4A-D) elke leiden tot een frameshift en vroege stop codon. Teneinde plpbp-null zebrafish larven, twee inleidingen werden gebruikt voor het versterken van de eerste codering exon met inbegrip van de mutatie-site (plpbp-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 "en plpbp-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3"). De versterking van het fragment van de plpbp in WT dieren resulteert in een 272-bp amplicon (homoduplex). De amplicon verkregen plpbpot101 (4-bp schrapping allel, figuur 4C) bestaat uit een fragment van 268-bp en die van de plpbpot102 (5bp-substitutie, 2-bp schrapping allel, Figuur 4 d) 270-bp, zoals te zien in figuur 4A-B. Na denaturatie- en gloeien, zou de PCR fragmenten uit heterozygoot dieren heteroduplex en homoduplex DNA17bevatten. Homoduplex en heteroduplex bands gemakkelijk kunnen worden gescheiden en gevisualiseerd met behulp van polyacrylamide gelelektroforese (pagina). De heteroduplex van DNA om te migreren in een aanzienlijk trager tempo dan homoduplex DNA17wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van een open hoek tussen gecompenseerde en niet-overeenkomende DNA-strengen veroorzaakt door onvolkomen gloeien als gevolg van het optreden van mutaties. Verschillende migratiepatronen worden geproduceerd door verschillende mutaties. De heterozygoot genotypen (plpbp+/ ot101, plpbp+/ ot102) zou daarom kunnen weergeven, heteroduplex DNA-fragmenten, evenals de samengestelde heterozygote (plpbpot101/ot102) (figuur 4a-B). Precieze genotypering wordt verkregen door deze heteroduplex assay smelten als een unieke patroon van de pagina wordt opgehaald voor elk genotype en verschillende heterozygoot mutaties kunnen worden gevisualiseerd (figuur 4A-B). Homozygoot mutanten zou een homoduplex patroon in de gel van de pagina worden weergegeven en dus niet te onderscheiden naar WTs. Om te onderscheiden deze genotypen, moet een andere ronde van pagina gel analyses worden uitgevoerd in welke PCR producten van WT allelen moeten worden gemengd met de monsters worden bestudeerd, zoals elders beschreven17.
Ongeveer 90% (88/98) van de WT en heterozygoot embryo's werden met succes verhoogd naar volwassenheid (> 2 maanden). Zoals aldh7a1 en plpbp verlies-van-functie mutanten die een vroege dood fenotype worden weergegeven zijn, kunnen onbehandelde dieren niet worden verhoogd naar volwassenheid. De genotypen van alle overlevende WT en heterozygoot volwassenen waren echter identiek aan larvale fin knippen resultaten, wijzen op een 100% nauwkeurigheid voor de identificatie van de genotypes met de larvale fin biopsie procedure.
Figuur 1. Larvale fin clip. (A). niet-gescheiden larvale fin op drie dagen na bevruchting (dpf). De lijn geeft de site van transect, gelegen in de kloof van pigment. De zwarte pijlpunt toont de limiet van de caudal bloedsomloop. (B). larve volgende fin knippen procedure op 3 dpf. (C). larvale zebrafish fin hergroei op 5 dpf. Fin regeneratie uit een blastemal formatie is slechts 2 dagen na fin transect waargenomen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Procedure voor de larvale fin clipping. (A). de larven zijn geplaatst op de band gezet en overtollige embryo media wordt verwijderd. Onder de Microscoop, is de fin verbeelde op de regio van de pigment kloof zoals weergegeven in figuur 1A. Met behulp van een microscalpel, is de fin verzameld en geplaatst op een filtreerpapier oppervlakte gewoon door aanraking (B), en gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd als een zwarte vlek. Houd het stuk filtreerpapier met de fin en knip een vierkantje rond de gewenste regio (C). Plaats het kleine stukje filtreerpapier met de fin in een putje van een 96 goed plaat (D). De larve van de overeenkomstige moet worden geplaatst in de corresponderende goed van een flat-96-Wells bodemplaat in 200 µL van embryo media (E). Het filtreerpapier stuk moet worden ondergedompeld in de lysis van de oplossing (F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Genotypering van aldh7a1 heterozygoot Kruis van larvale fin biopsieën. (A). Verwachte resultaat waar versterking van zowel de WT en de aldh7a1ot100 allelen in een 434-bp amplicon resulteert. Een band van 293-bp vloeit voort uit de versterking van de mutant allel (aldh7a1ot100, 5-bp invoegen), en een band 195-bp wordt verkregen voor de WT-allel. (B). voorbeeld van PCR versterking van aldh7a1 larval fin weefsels. Een markering van 1 kb molecuulgewicht wordt weergegeven in baan 7. Rijstroken 1-6 elk vertegenwoordigen een biopsie enkele fin. PCR-resultaten identificeren aldh7a1- / - (aldh7a1-ot100/ot100) genotypen lane (1), aldh7a1+/- heterozygoot genotypen (aldh7a1+/ ot100) (banen 3, 4 en 5) en WT () aldh7a1+/ +) genotypen (rijstroken 2 en 6). (C). uitlijning tussen de gesequenceerd WT en de aldh7a1ot100 -allel waarop de plaats van de 5-bp invoeging mutatie. Deze figuur werd uit het supplementaire figuur 5 van Pena et al. aangepast 9 met toestemming verleend uit de Genetics Society of America. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Genotypering van plpbp samengestelde heterozygote (2 bp verwijdering /4 bp schrapping) van larvale fin biopsieën. (A). Verwachte resultaat waar versterking van het WT-allel in een 272-bp amplicon resulteerde. De schrapping van de 4-bp-allel (plpbpot101) en de vervanging van de 5-bp met 2-bp schrapping allel (plpbpot102) produceren amplicon lengtes van 268-bp en 270-bp respectievelijk. Een heteroduplex wordt gevormd tussen een allel WT en de mutant allel in een heterozygoot genotype (plpbp+/-). Vorming van een heteroduplex als gevolg van mismatching allelen zal leiden tot vertraging van de band binnen de gel in vergelijking met de WT-homoduplex. (B). PCR versterking als gevolg van larvale fin knipsels van de nakomelingen van een plpbp+/ ot101x plpbp+/ ot102 Kruis. Een markering voor het molecuulgewicht van 1 kb wordt in baan 1 weergegeven. Rijstroken 2-10 per stuk vertegenwoordigen een biopsie enkele fin. PCR-resultaten identificeren mutant genotypen (plpbp-null samengestelde heterozygote plpbpot101/ot102, rijstroken 2, 4 en 8), heterozygoot genotypen (banen 3, 6, 7, 9 en 10) en WT genotypen (lane 5). (C). uitlijning tussen de gesequenceerd WT en de plpbpot101 -allel waarop de plaats van de 4-bp schrapping mutatie. (D). uitlijning tussen de gesequenceerd WT en de plpbpot102 -allel waarop de plaats van de 2-bp verwijdering en vervanging van de 5-bp (vet). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Onderdelen | 20 μl reactie | 100 reacties | Definitieve Conc. |
| Nuclease-vrije H2O | 7.45 ΜL | 745 ΜL | |
| Go-Taq 2 x (Promega, M7122) | 10 ΜL | 1000 ΜL | 1 x |
| primer Gen1_FW | 0,25 l | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| primer 5 nt-ins-specific_FW | 0,3 ΜL | 30 ΜL | 0,15 ΜM |
| Primer Gen2_RV | 0,25 l | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| Primer WT-specific_RV | 0,25 l | 25 ΜL | 0,125 ΜM |
| DNA | 1.5 l | -- |
Tabel 1. Reactie voorwaarden voor multiplex PCR gebruikt voor de aldh7a1 allel in dit protocol. De inleidingen gebruikt zijn als volgt: Gen1_FW-5' - ATGATGCAGCGCGTGCTGAC - 3', "Gen2_RV": 5' - CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3 ","5 nt-ins-specific_FW": 5'-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3", en "WT-specific_RV": 5'-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3'. Primer voorraden waren 10 µM.
| Onderdelen | 13 μl reactie | 100 reacties | Definitieve Conc. |
| H2O | 3.25 ΜL | 325 ΜL | |
| Go-Taq 2 x (Promega, M7122) | 6,25 ΜL | 625 ΜL | 1 x |
| primer FW | 1 ΜL | 100 ΜL | 0.77 ΜM |
| Primer RV | 1 ΜL | 100 ΜL | 0.77 ΜM |
| DNA | 1.5 l | -- |
Tabel 2. Reactie voorwaarden voor PCR gebruikt voor plpbp allel in dit protocol. De voorwaartse primer gebruikt was PLPBP-F 5'-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 "en de omgekeerde, PLPBP-R 5'-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3". Primer voorraden waren 10 µM.
| Cyclus stap | Temp. | Tijd | Cycli |
| Eerste denaturatie | 95 ° C | 3 min | 1 |
| Denaturering | 95 ° C | 30 sec | 36 |
| Gloeien * | X ° C | 30 sec | |
| Uitbreiding | 72 ° C | 20 sec/kb | |
| Final Extension | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 ° C | Houd |
Tabel 3. PCR voorwaarden die in dit protocol worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gen het uitgeven hulpmiddelen hebben gewerkt om juist mutaties en transgenen in zebrafish in de afgelopen jaren5,,6,,7,8. Bij het uitvoeren van ziekte modelleren in zebrafish, zijn vroege larvale of juveniele fenotypen vaak waargenomen9,12,13,14. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de extractie van DNA PCR-klaar van kleine zebrafish larvale staart biopsieën, inschakelen van genotypering van larven zo jong als 3 dpf. Vroegtijdige onderkenning van genotypen is cruciaal voor verschillende laboratorium toepassingen, vooral wanneer post hoc genotypering niet mogelijk9 is. Wetende genotypen van jongs vergemakkelijkt ook overleving studies en fenotypische analyse van mutanten. Dit protocol is ook bijzonder nuttig zijn voor het bijeenbrengen van de larven van bepaalde genotypen naar volwassenheid. Larvale genotypering is nog niet algemeen gebruikt in zebrafish laboratoria over de hele wereld en dit protocol heeft tot doel de verspreiding van deze techniek te vergemakkelijken. Terwijl het manipuleren van de transected vinnen, biedt het gebruik van deze methode vertrouwen over de aanwezigheid van DNA in het monster; de fin biopsie kan gemakkelijk worden gevisualiseerd als een donkere vlek op het filtreerpapier gedurende het proces van de behandeling. Dit vertegenwoordigt een belangrijke verbetering van het protocol gepubliceerd door Wilkinson et al. 16.
Verschillende kritische stappen binnen het protocol moeten correct worden gevolgd om kwaliteitsresultaten te verkrijgen. Eerst en vooral, moet het transect van het larvale fin plaatsvinden binnen de pigment kloof, distale op de grens van de bloedsomloop, om te voorkomen dat het bloeden. Dit zorgt voor de overleving van de larven tijdens de fin biopsie. Bovendien moet een zwarte stip op het filtreerpapier, markering van de plaatsing van de fin, alvorens het koffiefilter in de NaOH-oplossing worden nageleefd. Dit verzekert de aanwezigheid van de fin weefsel (en dus DNA) in elk monster goed. Het koffiefilter moet ook worden ondergedompeld in de NaOH-oplossing te waarborgen van lysis van de cel en succesvolle DNA-extractie. Dit protocol werd niet getest op jongere leeftijd dan 3 dpf als pas uitgekomen larven werden gebruikt. Op genotype jongere embryo's (unhatched < 3 dpf) verwijdering van de chorion nodig zou zijn. In het geval die onvoldoende PCR versterking optreedt, moeten standaard PCR optimalisatie strategieën worden toegepast (bijvoorbeeld variërend van primer concentratie, temperatuur en/of DNA concentratie gloeien) Hoewel voldoende DNA wordt gewonnen voor het succesvol uitvoeren van verschillende soorten PCR reacties (zoals bijvoorbeeld aldh7a1 en plpbp genotypering), de concentratie van DNA verkregen volgt fin knippen is klein (~ 5 ng/µL per voorbeeld) en dus verhoging van de concentratie van DNA in de PCR reactie kan toestemming geven voor meer succes voor amplificatie.
De larvale fin DNA geëxtraheerd met dit protocol kan worden gebruikt voor verschillende versterking reacties, waardoor nauwkeurige identificatie van larvale zebrafish genotypen en met een hoge gegevensdoorvoer wijze. Een heteroduplex smelten assay in pagina gelen kan worden gebruikt voor identificatie van de verschillende mutaties17. Gezien het feit dat ~ 30 μL van DNA wordt verkregen per monster, en ~ 1-1,5 μL van DNA wordt gebruikt per PCR-reactie, kunnen ongeveer 30 PCR reacties per uitgepakte monster worden uitgevoerd. De PCR-producten zijn ook geschikt voor Sanger sequencing toepassingen; hoge kwaliteit van luidt werden verkregen, waardoor nauwkeurige bevestiging van WT en homozygoot mutant reeksen aldh7a1. Genoom-DNA-extractie van larvale zebrafish kent vele toepassingen in onderzoek. Het oorspronkelijke doel voor het ontwikkelen van dit protocol was om effectief genotype larven die niet kunnen volwassenheid als gevolg van specifieke mutaties in de aldh7a19 bereiken. Bovendien, dit protocol ingeschakeld de segregatie van genotypen en de observatie van epilepsie-geassocieerde fenotypen specifiek in aldh7a1- / - vis uit de larvale stadium verdere9. De bundeling van larven van elk genotype voor benaderingen zoals RNA extractie of metaboliet extractie kan nauwkeurig worden uitgevoerd na genotypering met behulp van deze larvale fin knippen procedure9. Kortom, na een korte periode van opleiding kunt een ervaren onderzoeker dit eenvoudige en tijd-efficiënte protocol, waarbij slechts minimale en goedkope reagentia, routinematig uitvoeren van honderden fin clips per dag. Het gebruik van dit protocol mogelijk gemaakt het onderzoek beschreven door Pena et al. en hopelijk een vergelijkbaar doel zal dienen voor de bredere Zebrafish Gemeenschap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedank de zeldzame ziekte modellen en mechanisme (RDMM) Network (gefinancierd door de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR) en het genoom Canada). CK wordt ondersteund door een UROP scholarship award (Universiteit van Ottawa). DLJ wordt ondersteund door een Vanier Canada Graduate beurs. IAP wordt ondersteund door een Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR) postdoctoral fellowship award. De auteurs bedanken de Genetics Society of America voor het verlenen van toestemming voor publiceren van dit protocol en het gebruiken van een aanpassing van de aanvullende figuur 5 van Pena, et al..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N.
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
