Summary
هنا نقدم طريقة بصريا إمكانات العمل في الصورة، على وجه التحديد في cardiomyocytes البطين مثل المستحثة pluripotent المستمدة من الخلايا الجذعية. الأسلوب الذي يستند إلى التعبير يحركها المروج بروتين فلوري المراعية للجهد.
Abstract
كارديوميوسيتيس المتولدة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (اللجنة التوجيهية-سم) أداة ناشئة في أبحاث القلب والأوعية الدموية. بدلاً من أن يكون عدد سكان متجانسة من الخلايا، تمثل اللجنة التوجيهية-CMs إنشاؤها بواسطة بروتوكولات المفاضلة الحالية خليط خلايا مع البطين-، أذينية-، وتعمل مثل العقدي، مما يزيد من تعقيد التحليلات المظهرية. ويرد هنا، طريقة لإمكانات العمل سجل بصريا على وجه التحديد من البطين مثل اللجنة التوجيهية-المهاجرة. ويتحقق ذلك بتوصيل لينتيفيرال مع بناء الذي مؤشر جهد المرمزة وراثيا تحت سيطرة عنصر المروج البطين على حدة. عندما يتم ترانسدوسيد اللجنة التوجيهية-المهاجرة مع هذا البناء، هو استشعار الجهد أعرب حصرا في البطين مثل الخلايا، تمكين غشاء البصرية الخاصة بالنوع الفرعي تسجيلات المحتملة باستخدام مجهر الأسفار الوقت الفاصل بين.
Introduction
Cardiomyocytes (CMs) المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) أداة ناشئة تشريح الآليات الجزيئية لأمراض القلب، للتحقيق في رواية العلاجات، وشاشة للآثار السلبية للمخدرات القلب1،2 ،3. منذ البداية، كانت الأمراض أرهيثموجينيك مثل تشانيلوباثيس أحد مجالات تركيز هامة لهذا المجال البحث4. ونتيجة لذلك، أساليب للتحقيق تعمل الكهربائية لنظام الإدارة الوظيفية، مثل عدم انتظام ضربات القلب أو التغييرات في الإجراءات المحتملة (AP) مورفولوجيس، في صميم هذه التكنولوجيا.
اعتبار هام في تطبيق اللجنة التوجيهية-المهاجرة إلا تؤدي الحالية التمايز القلب البروتوكولات في عدد سكان متجانسة من الخلايا. بدلاً من ذلك، أنهم بدلاً من خليط من الخلايا تشبه العقدة الجيب أذينية، والمهاجرة البطين على مستويات مختلفة من النضج5،6،،من78. عدم تجانس هذه يمكن أن تكون مصدر ذات صلة تجريبية تقلب، خاصة إذا كان يتم التحقيق معلمات مثل مدة AP (APD)، الذي جوهريا تختلف بين الأنواع الفرعية سم (مثلاً، APD أقصر في الرجفان مما في البطين اتفاقية الأنواع المهاجرة). النهج التقليدي لمعالجة هذه المشكلة هو التحقيق في اللجنة التوجيهية-CMs واحد باستخدام الأسلوب المشبك التصحيح وتصنيف كل خلية العقدي-، أذينية-، أو الشبيهة بالبطين، استناداً إلى مورفولوجيا أ فب9. يمكن تقييد أي تحليل اللاحقة ثم إلى الخلايا تمثل النوع الفرعي سم للفائدة. العيب الرئيسي لهذه الاستراتيجية هو الإنتاجية المحدودة وعدم قابلية التوسع. وعلاوة على ذلك، لا تسمح طبيعة الغازية التصحيح المشبك الكهربية تصوير الخلايا نفس التتابع على مدى فترات زمنية طويلة.
هنا، نحن نقدم تفاصيل التجريبية على أسلوب10 وضعت على بصريا صورة APs في أنواع فرعية محددة من اللجنة التوجيهية-المهاجرة. هذا يتغلب على مشكلة عدم تجانس النوع الفرعي ويزيد الإنتاجية مقارنة بالأساليب التقليدية، يسمح فينوتيبينج السريع للجنة التوجيهية-المهاجرة تحمل المتغيرات الجينية أو يجري وكلاء المكشوفة الدوائية بشكل كبير.
نظرة عامة على النهج التصوير الضوئية الخاصة بالنوع الفرعي
مؤشر جهد المرمزة وراثيا (جيفي)، تغيير خصائصه الأسفار عند depolarization و repolarization من غشاء الخلية، يستخدم للصور بصريا التغييرات من إمكانات غشاء الأنواع المهاجرة. جيفي المطبقة هنا هي البروتين الفلورسنت الاستشعار من الجهد فسفب-الجمهورية التشيكية11، الذي يتألف من مجال transmembrane الاستشعار عن الجهد تنصهر فيها زوج خضراء (البرسيم) وبروتين فلورسنت أحمر (mRuby2) (الشكل 1A). بسبب قرب fluorophores اثنين، نتائج إثارة البروتينات الفلورية الخضراء في جزء صغير من الطاقة الإثارة التي يجري نقلها إلى الأحمر نيون البروتين عن طريق نقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق). ولذلك، نتائج إثارة البروتينات الفلورية الخضراء في انبعاثات من الأخضر والأحمر البروتينات الفلورية (الشكل 1A، اللوحة العلوية). عند الخلية ديبولاريزيس، يحدث إعادة ترتيب هيكلية لاستشعار الجهد الذي يترجم إلى إعادة توجيه من البروتينات الفلورية اثنين، زيادة كفاءة الحنق. وهكذا، نقل أكثر من طاقة الإثارة من الأخضر للبروتين الأحمر نيون (الشكل 1A، لوحة أقل). نتيجة لذلك في خلية ديبولاريزيد، انبعاث فلورية خضراء باهتة، وأكثر إشراقا من انبعاث ومضان أحمر في زنزانة في استراحة غشاء المحتملة (الشكل 1B).
رقم 1: التصوير الضوئي من غشاء المحتملة مع فسفب-CR. (A) A تخطيطي يصور عمل البروتين الفلورسنت المراعية للجهد ويرد فسفب-الجمهورية التشيكية. عند ديبولاريزيشن لغشاء الخلية، إعادة ترتيب هيكلية في مجال الاستشعار عن بعد الجهد transmembrane يترجم إلى إعادة توجيه الأخضر (التجارة والنقل) والحمراء بروتين فلوري (RFP)، زيادة كفاءة فورستر إينتراموليكولار صدى نقل الطاقة (بكى). ويرد (ب) الانبعاثات الأطياف من فسفب على الإثارة التجارة والنقل في الخلايا في إمكانات غشاء يستريح (اللوحة العلوية) والخلايا ديبولاريزيد (أسفل اللوحة). التغيير الطيفية عند depolarization مبالغ فيها للوضوح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التغييرات في كفاءة الحنق النسخ المتطابق بتقلبات الغشاء المحتملة هي تصويرها استخدام مجهر الأسفار مزودة صورة الفاصل، الذي يفصل بين انبعاثات ومضان أحمر وأخضر ومشاريع منها على المناطق المجاورة اثنين من الرقاقة من كاميرا سكموس (الشكل 2). مع هذا الإعداد، انبعاث fluorescence في شريطين مختلفة الطول الموجي يمكن تسجيلها في وقت واحد، مما يسمح حساب نسبة الأسفار الأحمر إلى الأخضر تعبر الغشاء المحتملة في كل صورة من سلسلة الوقت الفاصل بين.
رقم 2: تكوين نظام التصوير- المكونات الرئيسية لنظام التصوير المستخدمة للصورة يصور التغيرات الطيفية من البروتين الفلورسنت المراعية للجهد النسخ المتطابق غشاء التغييرات المحتملة في عالية دقة زمنية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
يتحقق التعبير عن فسفب-الجمهورية التشيكية في نظام الإدارة الوظيفية عن طريق توصيل لينتيفيرال. مباشرة التعبير إلى نوع فرعي سم من الفائدة، يحتوي لينتيفيروس على عنصر مروج (محسن MLC2v ) محركات النسخ على وجه التحديد في البطين مثل اللجنة التوجيهية-CMs10. عندما يتم ترانسدوسيد اللجنة التوجيهية-المهاجرة التي تمثل مزيجاً خلايا الشبيهة بالرجفان والعقدي مثل البطين مثل مع هذا lentivirus، يتم التعبير عن فسفب-CR فقط في الخلايا الشبيهة بالبطين. منذ التصوير الضوئية إمكانات العمل يعتمد على هذا الاستشعار الفلورسنت، تمثل إمكانات العمل المسجلة حصرا سم النوع الفرعي للفائدة (الشكل 3).
الشكل 3: التعبير فسفب يحركها المروج للتصوير المحتملة غشاء نوع فرعي على حدة. () هذا التخطيطي يوضح كيف تتحقق التسجيلات إمكانات العمل البصرية الخاصة بالنوع الفرعي كارديوميوسيتي. (ب) اللجنة التوجيهية-المهاجرة المصابة مع فسفب تحت سيطرة البطين الخاصة MLC2v-محسن ترد. ويلاحظ التعبير عن استشعار الجهد فقط في البطين مثل نظام الإدارة الوظيفية في قناة التجارة والنقل (اللوحة اليمنى). وترد أيضا مرحلة التباين (الفريق الأوسط) وتراكب الصورة (اللوحة اليمنى). خطوط منقطة أبيض علامة حدود الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد Cardiomyocytes المستمدة من اللجنة التوجيهية للتصوير
ملاحظة: أساليب المفاضلة الثقافة والقلب اللجنة التوجيهية قد نشرت قبل12،،من1314 وهي لا تناقش هنا بالتفصيل. يوصي بتنقية اللجنة التوجيهية-المهاجرة بالتحديد لاكتات، أو فصل الخلية المغناطيسية، أو ميكروديسيكتيون اليدوي اعتماداً على التمايز البروتوكول المستخدم. بروتوكول التالية، اكسبلانتس ميكروديسيكتيد من ضرب المناطق، التي تم إنشاؤها باستخدام أحادي الطبقة تمايز بروتوكول13في اليوم 15 من التفريق القلب ومثقف حتى يوم 30 على ألواح المغلفة فيبرونيكتين كما هو موضح قبل10.
- تأخذ الخلية ألواح ثقافة الخروج من الحاضنة ويدويًا جمع explants القلب في أنابيب ميكروسينتريفوجي باستخدام ماصة 200 ميليلتر. بعد الترسيب، نضح ثقافة الخلية طافية وتغسل بلطف explants x 2 مع هانك موازنة الملح الحل (حبس).
- فصل اللجنة التوجيهية-المهاجرة بإضافة كولاجيناز النوع الثاني (430 U/mL في حبس) واحتضانها لهم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- بعد الترسيب الخلية الكبيرة المتبقية كتل، جمع المادة طافية يحتوي على واحد ينتابها اللجنة التوجيهية-المهاجرة وهذا إضافة إلى الطازجة سم الصيانة المتوسطة التي تحتوي على تركيز مصل بقرى الجنين عالية (FBS) (دميم-F12، 20% FBS, 2 مم لجلوتاميني والأحماض الأمينية غير الأساسية MEM 1: 100، 100 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين ومم 0.1 β-mercaptoethanol).
- كرر الانفصال إذا بقيت كتل الخلايا الكبيرة. جمع مفردة اللجنة التوجيهية-المهاجرة بالطرد المركزي وريسوسبيند لهم في متوسطة الطول تحتوي على تركيز FBS منخفضة (2% FBS).
- إعادة البذور مفردة اللجنة التوجيهية-المهاجرة في كثافة السماح بتصوير اللاحقة للخلايا المفردة في 3.5 سم أسفل زجاج ثقافة خلية ميكروديش التي قد تم المغلفة مع فيبرونيكتين (2 ميكروغرام/سم2). تحسين كثافة البذر قبل الشروع في تجارب الفائق. عادة، تكون 5-10 اكسبلانتس القلب كل طبق 3.5 سم كافية؛ ومع ذلك، وهذا يتوقف إلى حد بعيد على حجم explant ونقاء.
- ثقافة واحدة اللجنة التوجيهية-المهاجرة بعد على الانفصال في سم الصيانة المتوسطة التي تحتوي على نسبة 2% FBS لمالا يقل عن 48 ساعة لضمان انتعاش كافية.
ملاحظة: في الخطوات التالية، يتم ترانسدوسيد اللجنة التوجيهية-المهاجرة مع لينتيفيروس ترميز جيفي فسفب-الجمهورية التشيكية تحت سيطرة محسن MLC2v 10 تحقيق تعبير جيفي البطين على حدة. بدلاً من ذلك، لينتيفيرال بنيات مما يسمح بالتعبير عن جيفي تحديداً في العقدي أو الرجفان-مثل الخلايا، أو بناء غير محدد إيواء المروج PGK أعرب عن أوبيكويتوسلي، يمكن أن تستخدم10. لينتيفيرال والبلازميدات متاحة عند الطلب.
تنبيه: عند العمل مع جزيئات لينتيفيرال، التأكد من أن بيئة العمل بمستوى كاف من السلامة الأحيائية، التقيد بتعليمات السلامة للعمل مع العوامل المعدية المحتملة، واتخاذ احتياطات السلامة الضرورية. - إعداد متوسطة العدوى عن طريق خلط lentivirus10-الذي يحتوي على خلية ثقافة طافية، الذي كان ينتج في الخلايا HEK293 كما هو موضح قبل15، مع صيانة نظام الإدارة الوظيفية المتوسطة (راجع الخطوة 1، 3) بنسبة 1:1.
- إضافة بروميد هيكساديميثريني بتركيز 8 ميكروغرام/مل لتعزيز كفاءة الإصابة نهائية.
ملاحظة: بسبب العدوى عالية الكفاءة لتركيز اللجنة التوجيهية-CMs السابقة من لينتيفيروس عن طريق تنبيذ فائق عادة غير ضروري. - نضح المتوسطة صيانة سم من اللجنة التوجيهية-CMs واحدة واستبدالها بالمتوسط العدوى أعدت خلال الخطوات 1.7 و 1.8. ثقافة واحدة مصابة اللجنة التوجيهية-المهاجرة في متوسطة العدوى لمدة 12 ح عند 37 درجة مئوية. ثم نضح على المديين المتوسط واستبدله مرة أخرى سم الصيانة المتوسطة.
ملاحظة: يظهر إشارة الأسفار من جيفي 48 ساعة بعد الإصابة. تصوير تسجيلات المحتملة غشاء المستحسن، ح 72 بعد الإصابة في أقرب وقت ممكن، لضمان قوة إشارات الصحيحة. يمكن مثقف لمدة 3 أسابيع على الأقل واحد اللجنة التوجيهية-المهاجرة المصابة وتصويرها تسلسلياً. في حالة حدوث فوتوبليتشينج واسعة النطاق أثناء جلسة تصوير، يسترد إشارة الأسفار على مر الزمن. - قبل التصوير، وتبادل مستنبت الخلية عن طريق حل تيرودي لتستكمل مع Ca2 + (135 ملم كلوريد الصوديوم، 5.4 مم بوكل، مجكل 1 مم2، الجلوكوز 10 ملم، كاكل 1.8 مم2، و 10 ملم حبيس؛ الرقم الهيدروجيني 7.35).
2-تسجيلات المحتملة الغشاء بصري
- المكان قاعة التصوير التي تحتوي على اللجنة التوجيهية-المهاجرة في مرحلة المجهر المقلوب ابيفلوريسسينسي مجهزة صورة الخائن ومجموعات التصفية المناسبة كاميرا (مثلاً، كاميرا سكموس) قادرة على تصوير فائق السرعة في عالية حساسية.
ملاحظة: على سبيل المثال، استخدام تصفية 480/40 نانومتر فرقة-تمرير إثارة جنبا إلى جنب مع 500 نانومتر طويلة-تمرير مرآة مزدوج اللون في المجهر، وشمال البحر الأبيض المتوسط منذ فترة طويلة-تمرير 568 مرآة مزدوج اللون جنبا إلى جنب مع 520/28 نانومتر و 630/75 نانومتر الفرقة-تمرير الانبعاثات المرشحات من المقسم والصورة. للتصوير بخلية واحدة، يوفر هدفا غمر نفط عالية التكبير، والفتحة العددية عالية أفضل نسبة الإشارة إلى الضجيج. - إذا كانت سرعة الكهربائية المطلوبة، تثبيت أقطاب سرعة في قاعة التصوير وقم بتوصيلها بمولد تحفيز.
ملاحظة: كنا سرعة اقحم الواردة قطبين البلاتين وتركيبها في أطباق الثقافة الخلية أسفل الزجاج 3.5 سم. تم تصويرها في الخلايا الواقعة بين الأقطاب. المعلمات سرعة نموذجية نبضات مستطيلة من 5 مللي ثانية في المدة، مع سعة الخامس/سم 10 مسرى المسافة. - بشكل اختياري، استخدم مرحلة مجهر ساخنة لضمان درجة حرارة مستقرة للجنة التوجيهية-CMs أثناء التصوير، أو حتى حضانة مجهر دائرة إعداد إذا كان القصد من التصوير الطويلة الأجل.
- إحضار الخلايا إلى التركيز وخلية معربا عن جيفي في وسط ميدان العرض.
ملاحظة: يتم ذلك أكثر سهولة باستخدام العدسات المجهر استخدام بروتين فلوري أخضر (بروتينات فلورية خضراء) أو أحمر تعيين عامل تصفية البروتينات الفلورية (RFP) لتحديد الخلايا معربا عن جيفي. - تعيين مسار بصري حيث أنه يتم توجيه الضوء المنبعثة إلى التقسيم الصورة. التبديل المكعب عامل التصفية في المجهر إلى واحدة لتكون جنبا إلى جنب مع عوامل التصفية في التقسيم الصورة (انظر الجدول للمواد).
- في برنامج التحكم بالكاميرا، تعيين إعدادات اقتناء حتى لا يكون ممكناً التصوير عالية السرعة (مثلاً، 100 لقطة في الثانية، مع وقت تعرض من 10 مللي ثانية لكل إطار).
ملاحظة: عادة، وهذا ينطوي على binning بكسل الكاميرا (مثلاً، 8 × 8 بكسل رقاقة الكاميرا هي إهمال لتوليد بكسل واحد في الوقت الفاصل بين الفيلم). - قم بإعداد الصورة التقسيم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اثنين من الصور تمثل شريطين الطول الموجي الانبعاثات المختلفة ينبغي أن تكون مجاورة لبعضها البعض، كل الاحتلال أحد نصف الصورة.
ملاحظة: هذه الخطوة يجب أن يكون أداء x 1 فقط في بداية كل دورة التصوير. - تحقق، وإذا لزم الأمر، ضبط تركيز الصورة التي تنتجها الكاميرا.
- ضبط سطوع الضوء الإضاءة بحيث يتم تجنب أي التشبع بكسل؛ يمكن أن يتم هذا بسهولة باستخدام لوحة ألوان التي تمثل فيها مشبعة بكسل بلون فريد.
ملاحظة: خلال كل هذه التحضيرات قبل التصوير، تحد من تعرض العينة للإثارة الخفيفة إلى المبلغ اللازم (أيهل عدم إجازة الضوء لفترات طويلة من الوقت) لتجنب فوتوبليتشينج جيفي. - إعداد الحصول على السلسلة الزمنية (مثلاً، الصور 5000 في 100 لقطة في الثانية لمدة 50 سلسلة s). خافت الضوء في الغرفة (بما في ذلك شاشات الكمبيوتر) لتجنب التأثير على القياس ضوء شارد. إذا كان مصراع الإثارة الخفيفة لا تخضع برامج التصوير، فتحه فقط قبل البدء في شراء.
- بدء الحصول على سلسلة الصور. إذا كان المطلوب هو سرعة الكهربائية، بدء تسلسل سرعة في هذه النقطة في الوقت المناسب، إلا أنه يتم البدء تلقائياً بواسطة برامج التصوير. إذا كان تطبيق عميل الدوائي مطلوب، القيام بذلك أما يدوياً (مثلاً، من بيبيتينج ميليلتر 100 عامل بعشرة إضعاف تركيز نهاية لدائرة التسجيل الذي يحتوي على 900 ميليلتر من المخزن المؤقت، ومخالطة بلطف الماصة) أو باستخدام نظام التروية تدفق ثابت.
- عند الانتهاء من اقتناء إغلاق مصراع الإثارة الخفيفة إذا لزم الأمر. حفظ التسجيل على القرص الصلب.
- ترك إعدادات التسجيل (أيوقت التعرض، ومعدل الإطار، وشدة الضوء) دون تغيير، القيام بتسجيل للأسفار الخلفية (كما هو الحال في الخطوة 2.11) عبر منطقة ساترة لا تحتوي على خلايا أو عبر ساترة آخر الذي لا وقد كان المصنف الخلايا.
ملاحظة: إذا يتم إجراء قياسات متسلسلة دون تغيير الإعدادات اقتناء، أمر ضروري لجميع هذه القياسات تسجيل الأسفار خلفية واحدة فقط. - إذا رغبت في ذلك، القيام بتجارب إضافية (خطوات 2.4 – 2.13) على اللجنة التوجيهية-المهاجرة المختلفة الموجودة على ساترة نفسها. كن على علم أن كل اتفاقية الأنواع المهاجرة على ساترة سوف تتأثر في حالة تم تطبيقها مخدرات.
3-تحليل
> ملاحظة: اعتماداً على برامج التصوير المستخدمة (وهي عادة حزمة برمجيات المسجلة ملكية المقدمة من الشركة المصنعة للكاميرا أو الأسفار كله نظام التصوير)، قد يكون من الممكن إجراء تحليل الصور المكتسبة جزئيا أو حتى كلياً داخل حزمة البرمجيات. ومع ذلك، هنا سير عمل لتحليل الصور التي يمكن أن يؤديها مع برمجيات المصدر المفتوح (أيمنهاج تحليل الصورة إيماجيج)16، التي يمكن تثبيت سهولة استخدام توزيع مثل فيجي17، ومجموعة البحث والتطوير ل ويرد وصف الحوسبة الإحصائية18 . باختصار، يتم رسم المناطق ذات الاهتمام (رويس) تمثل الخلايا أو الخلفية في إيماجيج، والأسفار يعني في هذه رويس مع مرور الوقت يتم تصديرها إلى ملف لمواصلة تحليلها، ثم، في البحث والتطوير، أو بدلاً من ذلك، مع برامج جداول البيانات.
- في برامج التصوير، حفظ أو تصدير السلسلة الزمنية الصورة المكتسبة (تحتوي على الخلايا التسجيل وتسجيل الخلفية المقابلة) إلى صيغة (مثلاً، TIF) التي يمكن قراءتها بواسطة إيماجيج. وبدلاً من ذلك، استخدم البرنامج المساعد بيوفورماتس (https://imagej.net/Bio-Formats)، التي تنص على إجراءات تمكن ImageJ قراءة تنسيقات الملفات المسجلة الملكية من مختلف العلامات التجارية للشركات المصنعة لنظام التصوير.
ملاحظة: تفترض الخطوات التالية أن فترات التصوير هي نفسها في جميع أنحاء التسجيل. إذا كان هذا ليس هو الحال، فإنه قد يكون من الضروري تصدير معلومات التوقيت من برامج التصوير وإدراجه في مزيد من التحليل. - افتح المكدس TIF التي تحتوي على الخلايا في إيماجيج.
- استخدم أداة التحديد اليدوي لرسم العائد على الاستثمار أكثر كارديوميوسيتي فلورية في القناة الحمراء. التأكد من أن العائد على الاستثمار كبيرة بما يكفي حتى أن الخلية لا الخروج من العائد على الاستثمار في حين التعاقد.
- فتح مدير البرنامج المساعد عائد الاستثمار ('تحليل | أدوات | مدير دوروا ') واضغط على زر ' إضافة [تي] ' لإضافة هذا العائد على الاستثمار ك ROI1.
- اسحب نفس الخلية في قناة الأخضر العائد على الاستثمار وإضافة عائد هذا الاستثمار ك ROI2.
- في ' تحليل | تعيين قياسات القائمة, إلغاء تحديد كافة خيارات باستثناء 'يعني قيمة الرمادي'.
ملاحظة: هذا قد يتم x 1 فقط في جلسة عمل إيماجيج. - في إدارة العائد على الاستثمار، اضغط ' أكثر | مقياس متعدد ' زر. حدد خيارات 'قياس كل الشرائح' و 'صف واحد لكل شريحة' واضغط 'موافق'. يفتح نافذة تحتوي على جدول بيانات مع ثلاثة صفوف (رقم الشريحة والأسفار يعني في رويس اثنين تمثل الخلية الموجودة في الحمراء وقناة الأخضر، على التوالي).
- استخدام ' الملف | حفظ باسم لحفظ جدول البيانات إلى ملف قيم مفصولة بفاصلة (CSV).
- قم بإغلاق النافذة مع المكدس الصورة وإطار جدول البيانات دون إغلاق إطار إدارة العائد على الاستثمار. افتح المكدس TIF التي تحتوي على قياس الخلفية.
- في إدارة العائد على الاستثمار، اضغط ' أكثر | مقياس متعددزر' . حدد خيارات 'قياس كل الشرائح' و 'صف واحد لكل شريحة' واضغط 'موافق'.
- استخدام ' الملف | حفظ باسم حفظ جدول البيانات مع البيانات الخلفية في ملف CSV آخر.
ملاحظة: يمكن القيام العمليات الحسابية التالية مع برامج جداول البيانات. قمنا باستخدام البرمجيات ص18. وتقدم نصي مثال بسيط الذي يقرأ بيانات الخلية وخلفية من ملفات "cell.csv" و "background.csv" يقوم بالعمليات الحسابية، ويرسم مسار الوقت إشارة محتملة غشاء التكميلي 1 ملف التعليمات البرمجية. - من تسجيل الخلفية، حساب متوسط كثافة في الحمراء وفي قناة الأخضر. طرح هذه الإشارات الخلفية من الإشارات التي تمثل الخلية في القناة الحمراء والخضراء لحساب طلب تقديم العروض لتصحيح الخلفية وإشارات التجارة والنقل، على التوالي.
- كبديل للغشاء المحتملة، حساب نسبة RFP/التجارة والنقل.
ملاحظة: هذه النسبة دون أبعاد. بدلاً من ذلك، يمكن أن يكون تطبيع إلى قيمته الأولية (أي، ΔR/R0). الأهم من ذلك، ترد معلومات مفيدة في التغيرات الزمنية بدلاً من القيم المطلقة لهذه النسبة. بسبب تفاوت فوتوبليتشينج في التجارة والنقل وطلب تقديم العروض، قد يحدث انجراف أساس في هذه النسبة. إذا لزم الأمر، يجوز تصحيح هذا انجراف أساس عن طريق تشييد خط منحنى وطرح عليه من طلب تقديم العروض/بروتينات فلورية خضراء نسبة10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الشكل 4a، هو يصور واحد ممثل اللجنة التوجيهية سم مع خطوط منقطة أبيض وسم دوروا رسمها أثناء تحليل التصوير في طلب تقديم العروض (الجانب الأيسر) وقناة التجارة والنقل (الجانب الأيمن). الإشارة من القناة طلب تقديم العروض يظهر زيادة دورية في شدة الفلورسنت خلال كل إمكانات العمل (الشكل 4 باء، اللوحة العلوية). كما ورد في المقدمة، وهذا سبب الحنق متزايدة الناجمة عن تغيرات في غشاء المحتملة (الشكل 1). كونكوردانتلي، وإشارة بروتينات فلورية خضراء يدل على انخفاض دورية في شدة الفلورسنت (الشكل 4 باء، الفريق الأوسط). نسبة RFP/التجارة والنقل (الشكل 4 باء، لوحة السفلي) هي إشارة البيولوجية المستخدمة في التحليلات المتلقين للمعلومات، مثل APD50 و90 APD القياسات. باستخدام هذا الأسلوب، وعمرها 30 يوم البطين مثل اللجنة التوجيهية-المهاجرة الإيقاع في 0.5 هرتز يعني APD50 (مدة ابتداء من إمكانات العمل حتى يتم إكمال repolarization نسبة 50 في المائة) وأظهرت 439 مرض التصلب العصبي المتعدد (± 46 ms) ويعني APD90 (مدة حتى يتم إكمال repolarization نسبة 90 في المائة) من 520 مللي ثانية (± 47 ms) (الشكل 4 ج).
الشكل 4: مبادئ تحليل الصور والخصائص الأساسية العمل المحتملة. () طلب تقديم العروض في وقت واحد مسجل (الجانب الأيمن) ويظهر الأسفار التجارة والنقل (الجانب الأيسر) اللجنة التوجيهية-سم واحد. تمثل الخطوط المنقطة البيضاء مناطق الاهتمام (ROI) المستخدمة في تحليل التصوير. (ب) آثار الخام من خلفية لتصحيح طلب تقديم العروض، التجارة والنقل، وتظهر إشارات RFP/بروتينات فلورية خضراء المستمدة من العائد على الاستثمار. (ج) ترد الوسائل ووزارة شؤون المرأة APD90 و APD50 من واحد البطين مثل اللجنة التوجيهية-المهاجرة في درجة حرارة الغرفة، ومع سرعة 0.5 هرتز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
لإثبات أن الطريقة أيضا قادرة على التقاط التغييرات في مدة العمل المحتملة، حفز اللجنة التوجيهية-المهاجرة كهربائياً في زيادة تحفيز معدلات تتراوح ما بين 0.4 إلى 2.5 هرتز، زيادة المعدل يدق كل خمسة (الشكل 5). ويبين الشكل 5aإشارة محتملة غشاء سجلت بصريا نموذجية من اللجنة التوجيهية-سم واحد. كان متوسط إمكانات العمل الأربعة الأولى على كل حال الضرب، مما يدل تقصير تدريجي من إمكانات العمل بمعدلات زيادة الضرب (الشكل 5 (ب)). متوسط يدق الإيقاع اللاحقة طريقة فعالة للحد من الضوضاء الملازمة لإمكانات العمل بصريا سجلت10. تجدر الإشارة إلى أن التجربة يصور قد لا التقاط المبلغ الكامل لإمكانات العمل تعتمد على معدل تقصير ممكن، نظراً لأن نحن الإيقاع الخلية ليدق خمسة فقط كل معدل سرعة، التي قد لا تكون كافية للوصول إلى التوازن.
الرقم 5: تأثير سرعة تواتر مدة إمكانات العمل. () كان يسير بخطى اللجنة التوجيهية-سم زيادة ترددات تتراوح بين 0.4 2.5 هرتز كما هو مبين (البقول سرعة كهربائية واحدة تمثلها الأسهم). (ب) لكل تردد سرعة، حسبت آب متوسط من APs الأربعة الأولى في هذا التردد. يتم رسم APs متوسط كتراكب، مما يدل على تقصير مع زيادة معدلات سرعة وكالة اسوشييتد برس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
يمكن أيضا استخدام الأسلوب للتحقيق في الآثار الكهربية للأدوية المطبقة على اللجنة التوجيهية-المهاجرة (الشكل 6). هنا، إيسوبروتيرينول، مؤثر غير انتقائية β-أدرينوريسيبتور، طبقت عفويا، الضرب اللجنة التوجيهية-المهاجرة كما ورد، مما أدى إلى زيادة سريعة في معدل الضرب (الشكل 6a). ويبين الشكل 6bمنحنى استجابة لجرعة يظهر تأثير تركيزات مختلفة إيسوبروتيرينول على التردد الضرب من اللجنة التوجيهية-المهاجرة.
رقم 6: تأثير إيسوبروتيرينول على تكرار الضرب- () تتبع إمكانات العمل البصرية الخام الممثل من تلقاء أنفسهم-الضرب اللجنة التوجيهية-سم واحد يرد. إيسوبروتيرينول (بتركيز نهائي من 1 ميكرومتر) أضيفت إلى اللجنة التوجيهية-المهاجرة كما هو مبين بالشريط. (ب) منحنى الاستجابة للجرعة هذا يظهر تأثير تركيزات مختلفة إيسوبروتيرينول على التردد الضرب من اللجنة التوجيهية-تمثل الأشرطة CMs. خطأ الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تمكن الطريقة الموصوفة هنا على تسجيل بصري لوكالة الأنباء الجزائرية من نوع فرعي محدد (أي، البطين مثل الخلايا) من اتفاقية الأنواع المهاجرة التي ولدت من إيبسكس البشرية. اللجنة التوجيهية-المهاجرة البشرية أداة ناشئة للتصدي لمجموعة كبيرة من المشاكل الطبية والبيولوجية، والتمايز إلى أنواع فرعية سم مختلفة مصدرا هاما لتقلب التجريبية. باستخدام عناصر محددة المروج، يتحقق التعبير عن جيفي على وجه التحديد في اتفاقية الأنواع المهاجرة تمثل النوع الفرعي للفائدة، التي يتم تصويرها ثم بصريا.
اقتناء ناجحة لوكالة الأنباء الجزائرية من اللجنة التوجيهية-CMs واحد يعتمد على كثافة reseeding بعد الانفصال. إذا كانت الخلايا هي ريسيديد كثيفة جداً، أنها تستغرق وقتاً طويلاً للعثور على اللجنة التوجيهية-المهاجرة واحدة معزولة لا تشكل جزءا من سينسيتيوم الكهربائية. ومع ذلك، بذر الكثافات المنخفضة جداً تؤثر سلبا على بقاء الخلايا. وهكذا، الاختبار المنهجي لمختلف الكثافات بذر ينصح، خاصة قبل المشاركة في التجارب التي تعتمد على التصوير الفائق.
أثناء الحصول على الصورة، يخضع فسفب فوتوبليتشينج، مما قد يؤثر سلبا على نسبة الإشارة إلى الضجيج، لا سيما أثناء تجارب أطول. إذا كان فوتوبليتشينج السريع حاضرا أثناء التجربة، الرجاء التأكد من أن فتح مصراع الإثارة الخفيفة فقط أثناء الحصول على الصورة أو أثناء خطوات التحضير اللازمة (البحث عن والتركيز على الإعراب عن فسفب الخلايا)، التي ينبغي أن تكون تنفيذها بأسرع وقت ممكن. وبالإضافة إلى ذلك، الحد من قوة الإثارة الخفيفة إلى الحد الأدنى الضروري، وجعل استخدام النطاق الديناميكي للكاميرا عالية الحساسية المستخدمة للحصول على الصور.
عند رسم دوروا أثناء تحليل الصورة، أن تدرك أن اللجنة التوجيهية-المهاجرة التحرك خلال الانكماش، وينبغي أن تبقى ضمن العائد على الاستثمار في جميع الصور من المكدس الصورة. نظراً لطبيعة راتيوميتريك فسفب، أي حركة للخلية من العائد على الاستثمار لا يؤدي إلى إشارات اصطناعية، لكنها قد تؤثر سلبا على جودة الإشارة. ومع ذلك، رويس كبيرة جداً وتشمل المناطق غير المنتجة لإشارة دون داع كبير أيضا سلبا تؤثر على نسبة إشارة إلى الضجيج وينبغي تجنبها.
للحصول على نتائج ممثلة، ميزت اللجنة التوجيهية-المهاجرة التي سمحت لتنضج لمدة 30 يوما على الأقل بعد أن تم استخدام تعريفية القلب. بعد هذه الفترة من النضج، سم مختلفة الأنواع الفرعية، مثل العقدي-، أذينية-، أو يمكن تمييز الخلايا الشبيهة بالبطين. هذه الخلايا هي لا تزال غير ناضجة، والوصول إلى فقط النمط الظاهري الجنينية مثل في نظم ثنائية الأبعاد (2-d) الثقافة التي تؤثر على خصائص الكهربائية، فضلا عن معالجة19الكالسيوم. هذه القيود العامة للجنة التوجيهية-المهاجرة يلزم النظر فيها، كما أنها قد يتيه النتائج التجريبية المستقلة للطريقة المستخدمة لقياس إمكانات العمل. نظم ثلاثية الأبعاد (3-D) الثقافة أكثر تقدما وقد أظهرت نتائج واعدة نحو مزيد من النضج20، والأسلوب الموصوفة هنا يمكن أن يكون مفيداً في هذا السياق.
معيار الذهب الحالية لقياس وكالة الأنباء الجزائرية للجنة التوجيهية-المهاجرة تسجيلات المشبك التصحيح، مما يسمح بإجراء تحليل مفصل جداً من خصائص AP مختلفة وحتى يمكن قياس التيارات قناة أيون واحد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن قياس قيم مطلقة (مثل، الغشاء يستريح المحتملة). على النقيض من ذلك، تستند الضوئية AP تسجيلات التغيرات النسبية لغشاء المحتملة. سبب حركية الجوهرية بطيئة نسبيا فسفب، بعض الخصائص AP، مثل "الانحسار"، قد يكون حدث من القراءات، وكوانتيتيشن ذات مغزى من ملامح سريعة، مثل سرعة أوبستروكي AP، ليس من الممكن. ومع ذلك، في إنشاء تجريبية نموذجية، لا القيم المطلقة، ولكن الاختلافات في القيم (مثلاً، بين خطوط خلية مختلفة أو قبل وبعد تطبيق دواء) تقاس. ويمكن تحقيق موثوق بالطريقة الضوئية الموضحة في هذه المخطوطات لخصائص مثل مدة AP (مثلاً، APD90 أو APD50) أو معدل الضرب، مع إنتاجية أعلى كثيرا مقارنة بالتصحيح المشبك10 . وعلاوة على ذلك، تسمح طبيعة هذه التكنولوجيا غير الغازية قياسات متعددة من نفس الخلية عبر الوقت10. وهكذا، ينبغي اعتبارها أدوات تكميلية الضوئية AP التسجيلات والمشبك التصحيح واستخدامها اعتماداً على التجربة والسؤال الذي يحتاج إلى إجابة.
يمكن تحقيق الضوئية AP التسجيلات بالتعبير عن جيفي أو بتطبيق صبغة الفلورسنت فرق الجهد (مثلاً، دي-8-أنيبس)21. الأصباغ الفلورية عادة أكثر مواتاة fluorescence حركية ولكن لا يمكن أن توجه إلى نوع فرعي معينة من كارديوميوسيتيس كما أنها هي لا وراثيا المرمزة. وقد عدد من جيفيس استناداً إلى مبادئ التشغيل المختلفة المتقدمة22. وهنا، يستخدم المستندة إلى الحنق جيفي فسفب-الجمهورية التشيكية11 . والسبب الرئيسي لهذا الاختيار هو الطابع راتيوميتريك لهذا المؤشر، الذي يتفاعل مع ديبولاريزيشن الخلوية مع زيادة في الحمراء وانخفاض في الأسفار خضراء إذا هو متحمس البروتينات الفلورية الخضراء. هذا مفيد في مجال أمراض القلب لأقل عرضه للآثار الناجمة عن حركات الخلية بسبب تقلصات cardiomyocytes من المؤشرات التي تستجيب ديبولاريزيشن فقط بتغيير مؤشر راتيوميتريك بهم كثافة الأسفار.
بينما يتم عرض النتائج فقط من التجارب التي تستهدف البطين مثل اللجنة التوجيهية-CMs باستخدام محسن MLC2v هنا، من الممكن أيضا لاستهداف أذينية أو العقدي-مثل استخدام العناصر المختلفة الخاصة بالنوع الفرعي المروج10سم. لوصف طريقة بالتفصيل، ركزت هذه المخطوطة على التصوير واحد اللجنة التوجيهية-المهاجرة التي تبذر في ساترة زجاج، وهذا يتيح تحليل خصائص المضادة للخلايا المفردة، وتوفر أعلى نسبة إشارة إلى الضجيج. بيد أن هذه التكنولوجيا تمكن أيضا تصوير اتفاقية الأنواع المهاجرة التي تتكامل مع خلايا أخرى في سينسيتيوم كهربائية أو بنية ثلاثية الأبعاد. وهذا الاهتمام الخاص كنماذج الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد تستخدم بشكل متزايد، وقد ثبت أن توفر خصائص مختلفة من نماذج 2-د20. اعتماداً على الإعداد التصوير وتعريف رويس، يمكن تحليل إشارات ضوئية من مساحات أكبر من الأنسجة ثلاثي الأبعاد أو من خلايا مفردة داخل الأنسجة. وعلاوة على ذلك، يمكن تصويرها في نفس الوقت خلايا متعددة وتحليلها بشكل منفصل، مما أدى إلى زيادة كبيرة في الإنتاجية.
أخذت معا، قد يحسن الطريقة المعروضة هنا انطباق اتفاقية الأنواع المهاجرة--اللجنة التوجيهية في مجال البحوث عدم انتظام ضربات القلب عن طريق تمكين phenotyping الضوئية السريعة للجنة التوجيهية-المهاجرة لتعمل المتعلقة بعدم انتظام ضربات القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل المنح المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية (Si 1747/1-1) وآخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ für Deutsche Stiftung هيرزفورشونج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
- Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research. Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).
- Rocchetti, M., et al. Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).
- Sinnecker, D., et al. Modeling long-QT syndromes with iPS cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).
- Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art. Life Sciences. , 98-113 (2016).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Den Hartogh, S. C., Passier, R. Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity. Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).
- Schweizer, P. A., et al. Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229 (2017).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Chen, Z., et al. Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes. European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2008).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).
- Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scientific Reports. 7, 5464 (2017).
- Dorn, T., et al. Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity. Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).
- Kaestner, L., et al. Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).
