Summary
Qui presentiamo un metodo per immagine otticamente i potenziali di azione, in particolare in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ventricolare-come. Il metodo si basa sull'espressione di una proteina fluorescente tensione sensibile promotore-driven.
Abstract
Cardiomiociti generati dalle cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSC-CMs) sono uno strumento emergente nella ricerca cardiovascolare. Piuttosto che essere una popolazione omogenea delle cellule, l'iPSC-CMs generati da protocolli correnti di differenziazione rappresentano una miscela delle cellule con ventricolare-, atriale-e fenotipi nodale-like, che complica l'analisi fenotipiche. Qui, un metodo per registrare otticamente i potenziali di azione in particolare da ventricolare-come iPSC-CMs è presentato. Questo si ottiene attraverso la trasduzione lentivirale con un costrutto in cui un indicatore di tensione geneticamente codificato è sotto il controllo di un elemento promotore ventricolare-specifico. Quando iPSC-CMs vengono trasdotti con questo costrutto, il sensore di tensione è espresso esclusivamente in ventricolare-come le cellule, che permette registrazioni potenziali di membrana ottico sottotipo-specifici utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse.
Introduction
Cardiomiociti (CMs) derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) sono uno strumento emergente di sezionare i meccanismi molecolari di malattia cardiaca, per studiare nuove terapie e allo schermo per avverse cardiache effetti1,2 ,3. Fin dall'inizio, malattie aritmogene quali canalopatie sono stati un fuoco importante di questa ricerca zona4. Di conseguenza, metodi per studiare elettrici fenotipi di CMs, quali aritmie o cambiamenti di morfologie di potenziale di azione (AP), sono il cuore di questa tecnologia.
Una considerazione importante nell'applicazione della iPSC-CMs è che non provochino l'attuale protocolli di differenziamento cardiaco in una popolazione omogenea delle cellule. Invece, sono piuttosto una miscela di cellule che assomigliano al nodo seno atriale e ventricolare CMs a diversi livelli di maturazione5,6,7,8. Questa eterogeneità può essere un'importante fonte di variabilità sperimentale, soprattutto se i parametri come la durata di AP (APD) sono studiati, che intrinsecamente differiscono tra sottotipi di CM (ad es., l'APD è più breve in atriale rispetto a CMs ventricolare). L'approccio convenzionale per affrontare questo problema è indagare singolo iPSC-CMs utilizzando il metodo di patch clamp e classificare ogni cella come nodale-, atriale-, o ventricolare-come, in base alle sue AP morfologia9. Qualsiasi analisi successiva possono essere quindi limitato alle cellule che rappresenta il sottotipo di CM di interesse. Il principale svantaggio di questa strategia è la limitata velocità effettiva e la mancanza di scalabilità. Inoltre, la natura invasiva della patch ed elettrofisiologia morsetto non consente l'imaging delle stesse cellule in sequenza a periodi di tempo estesi.
Qui, forniamo dettagli sperimentali su un metodo10 sviluppato per otticamente immagine APs in sottotipi specifici di iPSC-CMs. Questo supera il problema dell'eterogeneità di sottotipo e aumenta notevolmente la velocità di trasmissione rispetto ai metodi convenzionali, permettendo la rapida fenotipizzazione di iPSC-CMs che trasportano varianti genetiche o essere esposti a farmacologico agenti.
Panoramica dell'approccio imaging ottico sottotipo-specifici
Un indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI), cui proprietà di fluorescenza cambi su depolarizzazione e ripolarizzazione della membrana cellulare, viene utilizzato per immagine otticamente cambiamenti del potenziale di membrana di CMs. La GEVI applicato qui è la proteina fluorescente-rilevamento della tensione VSFP-CR11, che consiste di un dominio transmembrana di rilevamento tensione fuso ad un paio di un verde (trifoglio) e una proteina fluorescente rosso (mRuby2) (Figura 1A). A causa della vicinanza di due fluorophores, l'eccitazione della proteina fluorescente verde risultati in una frazione dell'energia di eccitazione viene trasferito alla proteina fluorescente rossa tramite trasferimento di energia per risonanza (FRET). Di conseguenza, l'eccitazione della proteina fluorescente verde si traduce in un'emissione da sia il verde e il rosse proteine fluorescenti (Figura 1A, pannello superiore). Quando la cella depolarizza, si verifica una riorganizzazione strutturale nel sensore di tensione che si traduce in un riorientamento delle due proteine fluorescenti, aumentando l'efficienza FRET. Così, ancora di più l'energia di eccitazione viene trasferito dal verde alla proteina fluorescente rossa (Figura 1A, pannello inferiore). Di conseguenza, in una cella depolarizzata, l'emissione di fluorescenza verde è dimmer, e l'emissione di fluorescenza rossa è più luminoso in una cella a riposo il potenziale di membrana (Figura 1B).
Figura 1: imaging ottico della membrana potenziale con VSFP-CR. (A), A schema raffigurante l'azione della proteina fluorescente tensione sensibile CHE VSFP-CR è indicato. Al momento la depolarizzazione della membrana cellulare, una riorganizzazione strutturale nel dominio del transmembrane-rilevamento della tensione si traduce in un riorientamento del verde (GFP) e rossa proteina fluorescente (RFP), aumentando l'efficienza del Förster intramolecolare trasferimento di energia per risonanza (FRET). Sono raffigurati gli spettri (B) l'emissione di un VSFP all'eccitazione della GFP in cellule presso il potenziale di membrana di riposo (pannello superiore) e in cellule depolarizzate (pannello inferiore). Il cambiamento spettrale su depolarizzazione è esagerato per chiarezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le modifiche dell'efficienza della FRET mirroring le fluttuazioni del potenziale di membrana sono Imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza equipaggiato con un'immagine splitter, che separa le emissioni di fluorescenza rossa e verde e li proietta su due zone adiacenti di il chip di una fotocamera sCMOS (Figura 2). Con questo set-up, l'emissione di fluorescenza a due bande di lunghezza d'onda differente possa essere registrato simultaneamente, che permette il calcolo di un rapporto di fluorescenza rosso-verde in modo da riflettere il potenziale in ogni immagine di una serie di time-lapse di membrana.
Figura 2: configurazione del sistema di imaging. I componenti principali del sistema di imaging utilizzata per immagine sono raffigurati i cambiamenti spettrali della proteina fluorescente tensione-sensibili del mirroring i cambiamenti di potenziale di membrana ad alta risoluzione temporale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'espressione di VSFP-CR in CMs è raggiunto attraverso la trasduzione lentivirale. Per indirizzare l'espressione per il sottotipo di CM di interesse, il lentivirus contiene un elemento di promotore (il rinforzatore di MLC2v ) che spinge in particolare trascrizione in ventricolare-come iPSC-CMs10. Quando l'iPSC-CMs che rappresentano una miscela di cellule simil-atriale, nodale-come e ventricolare-come vengono trasdotti con questo lentivirus, VSFP-CR è espressa solo nelle cellule simil-ventricolare. Poiché l'imaging ottico potenziale d'azione dipende da questo sensore fluorescente, i potenziali di azione registrati rappresentano esclusivamente il sottotipo di CM di interesse (Figura 3).
Figura 3: espressione del promotore-driven VSFP per l'imaging di potenziali di membrana sottotipo-specifici. (un) questo schema Mostra come sono realizzate le registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici del cardiomyocyte. (b) iPSC-CMs infettato da un VSFP sotto il controllo della ventricolare specifiche MLC2v-enhancer sono mostrati. L'espressione nel sensore di tensione è osservata solo in ventricolare-come CMs nel canale GFP (pannello di sinistra). A vostra disposizione anche il contrasto di fase (pannello centrale) e l'immagine di sovrapposizione (pannello di destra). Le linee bianche tratteggiate segnano confini delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
1. preparazione di cardiomiociti derivati iPSC per l'Imaging
Nota: Metodi per la differenziazione di cultura e cardiaco iPSC sono apparse prima12,13,14 e non sono discussi qui in dettaglio. La purificazione di iPSC-CMs di microdissection manuale, separazione magnetica delle cellule o selezione di lattato è raccomandata, a seconda del protocollo di differenziazione utilizzato. Per il seguente protocollo, espianti di microdissected battendo zone, generata utilizzando un protocollo di differenziazione monostrato13, erano scattate il giorno 15 di una differenziazione cardiaca e coltivate fino al giorno 30 su piastre rivestite di fibronectina, come descritto prima delle10.
- Prendere la cella piastre di coltura fuori l'incubatrice e raccogliere manualmente gli espianti cardiaci nelle provette microcentrifuga utilizzando una pipetta 200 µ l. Dopo la sedimentazione, aspirare il supernatante di coltura delle cellule e lavare delicatamente gli espianti di equilibrato 2x con Hank sale soluzione (HBSS).
- Dissociare iPSC-CMs mediante aggiunta di collagenasi tipo II (430 U/mL in HBSS) e li Incubare a 37 ° C per 30 min.
- Dopo la sedimentazione della rimanente cella grande ciuffi, raccogliere il surnatante contenente il singolo dissociato iPSC-CMs e aggiungere questo fresco mezzo di manutenzione CM contenente una concentrazione alta di siero bovino fetale (FBS) (DMEM-F12, 20% FBS, 2mm L-Glutamine, 1: 100 MEM non essenziali aminoacidi, 100 U/mL penicillina-streptomicina e 0,1 mM β-mercaptoetanolo).
- Ripetere la dissociazione se restino grumi di grandi cellule. Raccogliere single iPSC-CMs di centrifugazione e risospendere li in mezzo CM contenente una bassa concentrazione di FBS (2% FBS).
- Reseeding singolo iPSC-CMs in una densità che permette la formazione immagine successiva delle singole cellule su un microdish cultura cellulare di 3,5 cm con fondo di vetro è stato rivestito con fibronectina (2 µ g/cm2). Ottimizzare la densità di semina prima di impegnarsi in esperimenti di alto-rendimento. Di solito, 5 – 10 espianti cardiache per ogni piatto di 3,5 cm sono sufficienti; Tuttavia, questo dipende fortemente la dimensione di espianto e la purezza.
- Cultura il singolo iPSC-CMs dopo la loro dissociazione in mezzo di manutenzione CM contenente il 2% FBS per almeno 48 h per garantire un sufficiente recupero.
Nota: Nei passaggi successivi, l'iPSC-CMs vengono trasdotti con un lentivirus GEVI VSFP-CR sotto il controllo di un rinforzatore di MLC2v 10 per ottenere un'espressione di GEVI ventricolare specifiche di codifica. In alternativa, costrutti lentivirali che permette di esprimere la GEVI specificamente in nodale o atriale-come le cellule, o un costrutto aspecifiche che harboring il promotore PGK espressa ubiquitariamente, possa essere usate10. Plasmidi lentivirali sono disponibili su richiesta.
Attenzione: Quando si lavora con particelle lentivirali, assicurarsi che l'ambiente di lavoro abbia il livello di biosicurezza adeguata, di rispettare le istruzioni di sicurezza per l'utilizzo di agenti potenzialmente infettivi e adottare le precauzioni di sicurezza necessarie. - Preparare il supporto di infezione mescolando i lentivirus10-contenenti coltura cellulare surnatante, che è stata prodotta in cellule HEK293 come descritto prima15, con mezzo di manutenzione CMs (Vedi punto 1.3) in un rapporto 1:1.
- Aggiungere bromuro di hexadimethrine ad una concentrazione finale di 8 µ g/mL per migliorare l'efficienza di infezione.
Nota: A causa dell'infezione ad alta efficienza di iPSC-CMs concentrazione preliminare di lentivirus attraverso ultracentrifugazione solitamente non è necessario. - Aspirare il mezzo di manutenzione CM dal singolo iPSC-CMs e sostituirlo con il mezzo di infezione preparato durante passaggi 1.7 e 1.8. Cultura il singolo infetto iPSC-CMs nel mezzo di infezione per 12 h a 37 ° C. Aspirare il mezzo, quindi sostituirlo nuovamente con mezzo di manutenzione di CM.
Nota: Un segnale di fluorescenza dalla GEVI appare 48h dopo l'infezione. Un imaging delle registrazioni di potenziale di membrana è raccomandato, 72 ore dopo l'infezione al più presto, per garantire una forza di segnale adeguato. Singola infetti iPSC-CMs possono essere coltivate per almeno 3 settimane e ripreso in modo sequenziale. In caso di vasto photobleaching durante una sessione di imaging, il segnale di fluorescenza recupera nel tempo. - Prima di formazione immagine, scambiare il mezzo di coltura cellulare di soluzione di Tyrode completati con Ca2 + (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, glucosio di 10 mM, 1,8 mM CaCl2e 10 mM HEPES; pH 7,35).
2. registrazioni di potenziali di membrana ottico
- Posizionare la camera imaging contenente l'iPSC-CMs sul palco di un microscopio a epifluorescenza invertito equipaggiato con uno splitter di immagine, il set di filtri appropriati e una fotocamera (ad esempio, una fotocamera di sCMOS) in grado di imaging ad alta velocità con un elevato sensibilità.
Nota: ad esempio, utilizzare un'eccitazione di 480/40 nm passa-banda filtro combinato con un 500 specchio dicroico passa-lungo nm nel microscopio e uno specchio dicroico di 568 nm long-pass combinato con 520/28 nm e 630/75 nm passa-banda emissione filtri nella barra di divisione di immagine. Per l'imaging di singola cellula, un obiettivo a immersione in olio ad alto ingrandimento, alta apertura numerica fornisce il miglior rapporto segnale-rumore. - Se è necessaria la stimolazione elettrica, installare elettrodi di stimolazione nella camera di imaging e collegarli ad un generatore di stimolo.
Nota: Abbiamo usato un inserto di pacing che conteneva due elettrodi di platino e montato in piastre di coltura di 3,5 cm con fondo di vetro cellulare. Le cellule situate fra gli elettrodi erano imaged. Parametri di stimolazione tipici sono impulsi rettangolari di 5 ms nella durata, con un'ampiezza di 10 V/cm di distanza dell'elettrodo. - Facoltativamente, è possibile utilizzare una fase di microscopio riscaldata per garantire una temperatura stabile di iPSC-CMs durante la creazione di immagini, o anche un microscopio incubazione camera set-up, se la formazione immagine a lungo termine è destinata.
- Portare le cellule alla messa a fuoco e mettere una cella esprimendo la GEVI nel centro del campo di visione.
Nota: Questo è più convenientemente fatto utilizzando gli oculari del microscopio utilizzando una proteina fluorescente verde (GFP) o un rosso proteina fluorescente (RFP) filtro impostato per identificare le cellule che esprimono la GEVI. - Impostare il percorso ottico in modo che luce emessa viene instradato alla barra di divisione di immagine. Passare il cubo di filtro nel microscopio ad uno per essere combinati con i filtri nella barra di divisione di immagine (Vedi Tabella materiali).
- Nel software di controllo della telecamera, è necessario impostare le impostazioni di acquisizione in modo che l'imaging ad alta velocità (ad esempio, 100 fotogrammi al secondo, con un tempo di esposizione di 10 ms per fotogramma) è possibile.
Nota: Di solito, questo coinvolge il binning dei pixel della fotocamera (ad es., 8 x 8 pixel del chip della fotocamera sono cestinate per generare un pixel nel filmato time-lapse). - Impostare l'immagine splitter secondo le istruzioni del fabbricante. Le due immagini che rappresentano le due bande di lunghezza d'onda di emissione diversi dovrebbero essere adiacente a vicenda, ognuno occupando una metà dell'immagine.
Nota: Questo passaggio deve essere eseguita solo 1x all'inizio di ogni sessione di imaging. - Controllare e, se necessario, regolare la messa a fuoco dell'immagine prodotta dalla fotocamera.
- Regolare la luminosità della luce illuminazione in modo che si evita qualsiasi saturazione dei pixel; Questo può essere fatto più facilmente utilizzando una tavolozza di colori in cui saturi pixel sono rappresentati da un unico colore.
Nota: Durante tutti questi preparativi prima di formazione immagine, limitare l'esposizione del campione all'eccitazione leggero per la quantità necessaria (cioè, non lasciare la luce su per lunghi periodi di tempo) per evitare il photobleaching della GEVI. - Impostare l'acquisizione delle serie temporali (ad esempio, 5.000 immagini a 100 fotogrammi al secondo per una durata di serie di 50 s). Dim la luce in camera (compreso il monitor del computer) per evitare luce diffusa che influenzano la misura. Se l'otturatore luce di eccitazione non è controllato con il software di imaging, è possibile aprirlo appena prima di iniziare l'acquisizione.
- Avviare l'acquisizione di serie di immagini. Se si desidera la stimolazione elettrica, avviare la sequenza di stimolazione al punto di tempo appropriato, a meno che non viene automaticamente avviato dal software di imaging. Se l'applicazione di un agente farmacologico è voluto, fare questo sia manualmente (ad es., pipettaggio 100 µ l dell'agente in una concentrazione di fine dieci volte per la camera di registrazione contenente 900 µ l di tampone e mescolando delicatamente con la pipetta) o utilizzando un sistema di perfusione di flusso costante.
- Una volta completato l'acquisizione, chiudere l'otturatore luce di eccitazione se necessario. Salvare la registrazione sul disco rigido.
- Lasciando le impostazioni di registrazione (vale a dire, tempo di esposizione, frame rate e intensità luminosa) invariate, eseguire una registrazione di fluorescenza di fondo (come al punto 2.11) sopra una regione del coprivetrino non contenenti cellule o sopra un altro vetrino coprioggetti su cui non cellule sono state seminate.
Nota: Se vengono effettuate misurazioni sequenziali senza modificare le impostazioni di acquisizione, un solo servizio di registrazione di fluorescenza è necessaria per tutte queste misure. - Se lo si desidera, è possibile eseguire ulteriori esperimenti (passaggi 2.4 – 2,13) su diversi iPSC-CMs situato sulla stessa coprivetrino. Essere consapevoli del fatto che tutti i CMs il coprivetrino si applicherà nel caso in cui una droga è stata applicata.
3. analisi
> Nota: A seconda del software di imaging utilizzata (che è in genere un pacchetto di software proprietario fornito dal produttore della fotocamera o la fluorescenza di intera sistema di imaging), può essere possibile eseguire l'analisi delle immagini acquisite in parte o anche interamente all'interno di questo pacchetto di software. Tuttavia, qui un flusso di lavoro di analisi delle immagini che possono essere eseguite con software open source (cioè, la piattaforma di analisi di immagine ImageJ)16, che può essere comodamente installato utilizzando una distribuzione come Fiji17e il pacchetto di R per calcolo statistico18 sono descritti. Brevemente, le regioni di interesse (ROI) che rappresentano celle o sfondo sono disegnate in ImageJ, e la media di fluorescenza in questi ROIs nel tempo viene esportata in un file per essere, quindi, ulteriormente analizzato R o, in alternativa, con il software del foglio elettronico.
- Il software di imaging, salvare o esportare le serie temporali di immagine acquisita (sia la registrazione che contiene le cellule e la corrispondente registrazione di sfondo) in un formato (ad es., TIF) che può essere letto da ImageJ. In alternativa, utilizzare il plugin BioFormats (https://imagej.net/Bio-Formats), che prevede procedure di abilitazione ImageJ leggere formati di file proprietari da diverse marche di produttori di sistemi di imaging.
Nota: La procedura seguente si presuppone che gli intervalli di imaging sono le stesse in tutta la registrazione. Se questo non è il caso, potrebbe essere necessario esportare le informazioni di temporizzazione dal software di imaging e includerlo nell'ulteriore analisi. - Aprire lo stack TIF contenente le celle in ImageJ.
- Utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per disegnare un ROI sopra un fluorescente del cardiomyocyte nel canale del rosso. Assicurarsi che il ROI è abbastanza grande in modo che la cella non si muove fuori il ROI contraendo.
- Aprire il plugin manager di ROI ('Analyze | Strumenti | Manager di ROI') e premere il pulsante 'Aggiungi [t]' per aggiungere questo ROI come ROI1.
- Trascinare il ROI sulla stessa cella nel verde del canale e aggiungere questo ROI come ROI2.
- Nella ' analizzare | Impostare delle misurazioni menu, deselezionare tutte le opzioni ad eccezione di 'Valore grigio medio'.
Nota: Questo deve essere fatto solo 1 x in una sessione di ImageJ. - Nel gestore di ROI, premere il ' più | Multi misura ' pulsante. Selezionare le opzioni di 'Misurare tutte le slices' e 'Una riga per ogni fetta' e premere 'OK'. Si apre una finestra contenente un foglio di calcolo con tre righe (il numero di slice e la media di fluorescenza nella due ROIs che rappresenta la cella nel rosso e nel verde del canale, rispettivamente).
- Uso ' File | "Save As' per salvare il foglio di calcolo in un file di valori separati da virgola (CSV).
- Chiudere la finestra con lo stack di immagine e la finestra del foglio di calcolo senza chiudere la finestra di gestione di ROI. Aprire lo stack TIF contenente la misura di sfondo.
- Nel gestore di ROI, premere il ' più | Multi misura' pulsante. Selezionare le opzioni di 'Misurare tutte le slices' e 'Una riga per ogni fetta' e premere 'OK'.
- Uso ' File | "Save As' per salvare il foglio di calcolo con i dati di sfondo in un altro file CSV.
Nota: I seguenti calcoli possono essere fatto con software del foglio elettronico. Abbiamo usato il software R18. Un semplice esempio di script che legge i dati di cella e lo sfondo dal file "cell.csv" e "background.csv" esegue i calcoli e traccia la rotta di tempo del segnale di potenziale di membrana viene fornito come File di codice supplementare 1. - La registrazione in background, calcolare l'intensità media nel rosso e nel verde del canale. Sottrarre questo segnale di fondo dai segnali che rappresenta la cella nel canale rosso e verde per calcolare la corretta sfondo RFP e segnali GFP, rispettivamente.
- Come un surrogato per il potenziale di membrana, calcolare il rapporto RFP/GFP.
Nota: Questo rapporto è adimensionale. In alternativa, che possa essere normalizzata al valore iniziale (cioè, ΔR/R0). Importante, informazioni utili sono contenute nei cambiamenti temporali piuttosto che in valori assoluti di questo rapporto. A causa di photobleaching irregolare la GFP e RFP, può verificarsi una deriva della linea di base in questo rapporto. Se necessario, tale una deriva della linea di base può essere corretto dalla costruzione di una curva della linea di base e sottraendo la RFP/GFP rapporto10.
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Representative Results
In Figura 4a, un singolo rappresentante iPSC-CM è raffigurato con le linee bianche tratteggiate marcatura il ROI disegnato durante l'analisi di imaging RFP (lato sinistro) e il canale GFP (lato destro). Il segnale dal canale RFP Mostra un aumento periodico intensità fluorescente durante ogni potenziale di azione (Figura 4b, pannello superiore). Come descritto nell'introduzione, questo è a causa di un crescente apprensione causata da cambiamenti nel potenziale di membrana (Figura 1). Concordemente, il segnale GFP Mostra una periodica diminuzione nell'intensità di fluorescenza (fig. 4b, pannello centrale). Il rapporto RFP/GFP (Figura 4b, pannello inferiore) è il segnale biologico utilizzato nelle analisi a valle, quali APD50 e APD90 misurazioni. Utilizzando questo metodo, un 30-giorno-vecchio ventricolare-come iPSC-CMs ritmo a 0,5 Hz ha mostrato una media APD50 (la durata dall'inizio del potenziale d'azione fino a quando la ripolarizzazione è completata da 50%) di ms 439 (± 46 ms) ed un mezzo APD90 (la durata fino a quando la ripolarizzazione è completata da 90%) di ms 520 (± 47 ms) (Figura 4c).
Figura 4: principi di analisi di immagine e le caratteristiche base potenziale di azione. (un) contemporaneamente registrato RFP (lato destro) e la fluorescenza di GFP (lato sinistro) di un singolo iPSC-CM è indicata. Le linee bianche tratteggiate rappresentano le regioni di interesse (ROI) utilizzato per l'analisi di imaging. (b) materie prime tracce di sottofondo-rettificato RFP, GFP, e segnali RFP/GFP derivati dal ROI sono mostrati. (c) sono mostrati i mezzi e SEM di APD90 e APD50 di singolo ventricolo-come iPSC-CMs a temperatura ambiente e con la cadenza di 0,5 Hz. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per dimostrare che il metodo è anche in grado di catturare le modifiche nella durata del potenziale d'azione, iPSC-CMs sono stati stimolati elettricamente all'aumento dei tassi di stimolazione che vanno da 0,4 a 2,5 Hz, aumentando la velocità di ogni cinque battiti (Figura 5). Un segnale di potenziale tipica membrana otticamente-registrato da un iPSC-CM è mostrato in Figura 5a. I primi quattro potenziali di azione a ogni velocità di battitura erano una media, dimostrando una progressiva riduzione dei potenziali d'azione al prezzo aumentato pestaggio (Figura 5b). Con una media di battute ritmo successive è un metodo efficace di ridurre il rumore inerente a otticamente-registrato i potenziali di azione10. Va ricordato che l'esperimento raffigurato non potrebbe catturare l'intero importo del potenziale di azione dipendente dalla velocità di accorciamento possibile, dato che abbiamo stimolato la cella per solo cinque batte a ogni tasso di stimolazione, che potrebbe non essere sufficiente per raggiungere l'equilibrio.
Figura 5: effetto della frequenza di stimolazione della durata del potenziale d'azione. (un) Un iPSC-CM è stato stimolato ad aumentare le frequenze che vanno da 0,4 a 2,5 Hz come indicato (gli impulsi di stimolazione elettrici singoli sono rappresentati da frecce). (b) per ogni frequenza di stimolazione, un AP media è stato calcolato dai primi quattro punti di accesso a questa frequenza. L'APs media vengono tracciata come un overlay, dimostrando l'AP accorciamento con l'aumento tassi di cadenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il metodo può essere utilizzato anche per studiare effetti elettrofisiologici dei farmaci applicati per l'iPSC-CMs (Figura 6). Qui, isoproterenolo, un agonista β-adrenergici non selettivi, è stato applicato spontaneamente-pestaggio iPSC-CMs come indicato, portando a un rapido aumento del tasso di pestaggio (Figura 6a). Una curva dose-risposta che mostrano l'effetto delle concentrazioni differenti di isoproterenolo sulla frequenza battito di iPSC-CMs è mostrata nella Figura 6b.
Figura 6: effetto di isoproterenolo sulla frequenza di battito. viene visualizzata la finestra di (un) l'analisi di potenziale d'azione crudo rappresentante ottico di un spontaneamente-pestaggio singolo iPSC-CM. Isoproterenolo (con una concentrazione finale di 1 µM) è stato aggiunto al iPSC-CMs, come indicato dalla barra. (b) questa curva dose-risposta viene illustrato l'effetto delle concentrazioni differenti di isoproterenolo sulla frequenza battito di iPSC-CMs. errore barre rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo qui descritto consente una registrazione ottica di APs da un sottotipo specifico (cioè, ventricolare-come le cellule) di CMs generato da iPSCs umane. Umano iPSC-CMs sono uno strumento emergente per affrontare una grande varietà di problemi biologici e medici, e la differenziazione di diversi sottotipi di CM è un'importante fonte di variabilità sperimentale. Utilizzando elementi specifici promotore, l'espressione di un GEVI è specificamente realizzato in CMs che rappresenta il sottotipo di interesse, che sono quindi otticamente imaged.
L'acquisizione di APs da singolo iPSC-CMs dipende dalla densità reseeding dopo la dissociazione. Se le cellule sono reseeding troppo densa, è che richiede tempo per trovare isolato singolo iPSC-CMs che non fanno parte di un sincizio elettrico. Tuttavia, troppo basso densità di semina influenzare negativamente la sopravvivenza delle cellule. Pertanto, una prova sistematica di diverse densità di semina è raccomandata, soprattutto prima di impegnarsi in esperimenti che dipendono da formazione immagine ad alta velocità.
Durante l'acquisizione dell'immagine, il VSFP subisce photobleaching, che potrebbe influenzare negativamente il rapporto segnale-rumore, soprattutto durante gli esperimenti più a lungo. Se rapido photobleaching è presente durante l'esperimento, assicurati che l'otturatore luce di eccitazione è aperto solo durante l'acquisizione di immagini o durante operazioni di preparazione necessarie (cercando e concentrandosi sulle cellule che esprimono VSFP), che dovrebbero essere eseguite più rapidamente possibile. Inoltre, ridurre la potenza dell'eccitazione luce all'importo minimo necessario e fare uso della gamma dinamica della fotocamera ad alta sensibilità utilizzata per acquisizione di immagini.
Quando si disegna il ROI durante l'analisi di immagine, essere consapevoli che iPSC-CMs spostare durante la contrazione e dovrebbe rimanere entro il ROI in tutte le immagini dello stack di immagine. A causa della natura di raziometrici della VSFP, qualsiasi movimento della cellula fuori il ROI non conduce ai segnali artificiali ma potrebbe influenzare negativamente la qualità del segnale. Tuttavia, ROIs che sono troppo grandi e includono inutilmente grandi aree di produzione di segnale anche negativamente influenzare il rapporto segnale-rumore e dovrebbe essere evitato.
Per i Risultati di rappresentante, differenziato iPSC-CMs che è stato permesso di maturare per almeno 30 giorni dopo un'induzione cardiaca sono stati utilizzati. Dopo questo periodo di maturazione, CM diversi sottotipi, come nodale-, atriale-, o ventricolare-come le cellule possono essere distinti. Queste cellule sono ancora immature e raggiungono solo un fenotipo embrionale come nei sistemi bidimensionali (2D) cultura che interessano proprietà elettriche come pure calcio movimentazione19. Queste limitazioni generali di iPSC-CMs devono essere considerati, come essi possono confondere i risultati sperimentali indipendenti del metodo utilizzato per misurare i potenziali di azione. Sistemi più avanzati di tridimensionale (3D) cultura hanno mostrato risultati promettenti verso ulteriore maturazione20, e il metodo qui descritto potrebbe essere prezioso in questo contesto.
Il gold standard attuale per misurazione APs di iPSC-CMs è patch morsetto registrazioni, che permettono un'analisi molto dettagliata delle caratteristiche differenti di AP e permette anche la misurazione dello ione singolo canale correnti. Inoltre, possono essere misurati i valori assoluti (ad esempio, il potenziale di membrana di riposo). Al contrario, le registrazioni ottiche AP si basano su variazioni relative del potenziale di membrana. Dovuto la relativamente lenta cinetica intrinseca della VSFP, alcune caratteristiche di AP, come ad esempio il "superamento", potrebbero essere ottuso dalle letture e una significativa quantificazione veloce funzionalità, ad esempio la velocità di salita di AP, non è possibile. Tuttavia, in un tipico set-up sperimentale, non i valori assoluti, ma le differenze nei valori (ad es., tra diverse linee cellulari o prima e dopo l'applicazione di un farmaco) sono state misurate. Questo può essere attendibilmente realizzato con il metodo ottico descritto in questo manoscritto per caratteristiche come la durata della AP (ad es., APD90 o APD50) o tasso di pestaggio, con un volume molto più elevato rispetto al morsetto patch10 . Inoltre, la natura non invasiva di questa tecnologia permette misurazioni multiple della stessa cella sopra tempo10. Così, le registrazioni ottiche AP e patch clamp dovrebbe essere considerati come strumenti complementari e utilizzati a seconda la questione sperimentale che deve essere risolta.
Le registrazioni ottiche AP possono avvenire sia dall'espressione di un GEVI o dall'applicazione di una tintura fluorescente potenziometrica (ad es., di-8-ANEPPs)21. Le tinture fluorescenti sono solitamente più favorevole cinetica di fluorescenza ma non possono essere indirizzate a un certo sottotipo dei cardiomyocytes come essi non sono geneticamente-codificati. Un numero di GEVIs basato su diversi principi di funzionamento è stati sviluppati22. Qui, viene utilizzato il basato su FRET GEVI VSFP-CR11 . La ragione principale per questa scelta è stata la natura raziometrici di questo indicatore, che reagisce alla depolarizzazione cellulare con un aumento in rosso e una diminuzione in fluorescenza verde se la proteina fluorescente verde è entusiasta. Questo è vantaggioso nel campo della cardiologia perché un indicatore di raziometrici è meno suscettibile di artefatti causati da movimenti delle cellule a causa di contrazioni dei cardiomiociti che gli indicatori che reagiscono a depolarizzazione soltanto da un cambiamento della loro intensità di fluorescenza.
Mentre solo risultati dagli esperimenti ventricolare-come iPSC-CMs utilizzando il rinforzatore di MLC2v di targeting sono presentati qui, è anche possibile atriale - o nodale-come CMs utilizzando diversi promotore di sottotipo-specifici elementi10di destinazione. Per descrivere il metodo in dettaglio, questo manoscritto focalizzata sulla singola iPSC-CMs che hanno seminato il vetrino coprioggetti, come questo permette l'analisi delle proprietà di AP di singole cellule e fornisce il più alto rapporto segnale-rumore di imaging. Tuttavia, questa tecnologia consente anche l'imaging del CMs che sono integrati con altre cellule in un sincizio elettrico o una struttura 3D. Questo è di particolare interesse come modelli della coltura cellulare 3D sono sempre più utilizzati e sono stati indicati per fornire proprietà diverse da modelli 2-D20. A seconda il set-up di formazione immagine e la definizione della ROIs, segnali ottici possono essere analizzati da più grandi zone del tessuto 3D o da singole cellule all'interno del tessuto. Inoltre, più celle possono essere imaged simultaneamente e analizzate separatamente, portando ad un aumento sostanza della velocità effettiva.
Presi insieme, il metodo presentato qui può migliorare l'applicabilità dell'iPSC-CMs nel campo della ricerca di aritmia consentendo la rapida phenotyping ottico di iPSC-CMs per i fenotipi di aritmia-correlati.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da German Research Foundation (Si 1747/1-1), l'altro Kröner-Fresenius-Stiftung e la Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
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