Summary
Hier präsentieren wir eine Methode, um optisch Bild Aktionspotentiale, insbesondere ventrikuläre erinnernden induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Kardiomyozyten. Die Methode basiert auf der Projektträger-gesteuerte Ausdruck eines Spannung-empfindlichen fluoreszierenden Proteins.
Abstract
Kardiomyozyten generiert aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-CMs) sind ein aufstrebenden Werkzeug in der Herz-Kreislauf-Forschung. Anstatt eine homogene Population von Zellen, repräsentieren die iPSC-CMs von aktuellen Differenzierung Protokolle erzeugt eine Mischung aus Zellen mit ventrikulären-, Vorhofflimmern-, und nodal-ähnlichen Phänotypen, die phänotypische Analysen erschwert. Hier ist eine Methode, um optisch Rekord Aktionspotentiale speziell von ventrikulären-wie iPSC-CMs präsentiert. Erreicht wird dies durch Lentivirale Transduktion mit einem Konstrukt, in dem ein genetisch codierte Spannungsanzeige unter der Kontrolle eines ventrikulären-spezifischen Promotor-Elements ist. Beim iPSC-CMs mit diesem Konstrukt ausgestrahlt werden, drückt sich die Spannungssensor ausschließlich in ventrikuläre-ähnlichen Zellen, Subtyp-spezifische optische Membran möglichen Aufnahmen mit Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht.
Introduction
Kardiomyozyten (CMs) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abgeleitet sind eine aufstrebende Werkzeug zu Molekulare Mechanismen von Herzerkrankungen, um neue Therapien zu untersuchen und zu Bildschirm für kardiale Nebenwirkungen Effekte1,2 sezieren ,3. Von Anfang an wurden Arrhythmogenic Krankheiten wie channelopathien ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung Bereich4. Infolgedessen sind Methoden zu untersuchen, elektrische Phänotypen von CMs, wie Herzrhythmusstörungen oder Änderungen der Aktionspotential (AP) Morphologien, das Herzstück dieser Technologie.
Ein wichtiger Aspekt bei der Anwendung der iPSC-CMs ist, dass die aktuellen Protokolle der kardialen Differenzierung nicht zu einer homogenen Bevölkerung der Zellen führen. Stattdessen sind sie eher eine Mischung aus Zellen ähnlich Sinusknoten, Vorhofflimmern, und ventrikuläre CMs auf verschiedenen Ebenen der Reifung5,6,7,8. Diese Heterogenität kann eine relevante Quelle der experimentellen Variabilität, vor allem, wenn Parameter wie AP-Dauer (APD) untersucht werden, die per se unterscheiden sich zwischen CM Subtypen (z. B.die APD ist kürzer im Vorhofflimmern als in ventrikuläre CMs). Der konventionelle Ansatz zur Lösung dieses Problems ist es, einzelne iPSC-CMs mit der Patch-Clamp-Methode zu untersuchen und um jede Zelle als Knotenpunkt zu klassifizieren-, Vorhofflimmern-, oder ventrikuläre-Like, basierend auf der AP-Morphologie-9. Jede nachfolgende Analyse kann dann auf die Zellen aus der CM-Untertyp von Interesse beschränkt werden. Der größte Nachteil dieser Strategie ist die begrenzten Durchsatz und Mangel an Skalierbarkeit. Darüber hinaus erlaubt die invasive Art der Patch-Clamp-Elektrophysiologie nicht die Bildgebung der gleichen Zellen nacheinander über längere Zeiträume.
Hier bieten wir experimentelle Details auf eine Methode10 entwickelt, um optisch APs Bild in bestimmte Subtypen der iPSC-CMs. Dies überwindet das Problem der Subtyp Heterogenität und dramatisch erhöht den Durchsatz im Vergleich zu herkömmlichen Methoden erlauben die schnelle Phänotypisierung von iPSC-CMs genetische Varianten oder ausgesetzt pharmakologische Agenten.
Überblick über den Subtyp-spezifische optische Bildgebung Ansatz
Ein genetisch codierte Spannungsanzeige (GEVI), deren Fluoreszenzeigenschaften Depolarisation und Repolarisation der Zellmembran zu ändern, wird verwendet, um Änderungen des Membran-Potentials CMS optisch Bild. Die hier angewandte GEVI ist das Spannung-sensing fluoreszierende Protein VSFP-CR11, bestehend aus einer Spannung-sensing transmembrane Domäne verschmolzen zu einem Paar von einer grünen (Klee) und eine rote (mRuby2) fluoreszierendes Protein (Abb. 1A). Aufgrund der Nähe der zwei Fluorophore ergibt sich die Erregung des grün fluoreszierenden Proteins in einem Bruchteil der Anregungsenergie auf das rot fluoreszierende Protein über Förster Resonanz Energietransfer (FRET) übertragen werden. Daher führt die Anregung für das grün fluoreszierende Protein in einer Emission von Grün und rot fluoreszierende Proteine (Abbildung 1A, obere Leiste). Wenn die Zelle erschüttert, tritt eine strukturelle Neuordnung der Spannungssensor, die zu einer Neuausrichtung der beiden fluoreszierende Proteine, Erhöhung der FRET-Effizienz führt. Somit ist noch mehr von der Anregungsenergie vom Grün, das rot fluoreszierende Protein (Abb. 1A, untere Leiste) übertragen. Infolgedessen in einer depolarisiert Zelle grüne Fluoreszenz-Emission ist dunkler, und die rote Fluoreszenz-Emission ist heller als in einer Zelle bei ruhenden Membranpotential (Abbildung 1 b).
Abbildung 1: optische Bildgebung des Membranpotentials mit VSFP-CR. (A) A schematische Darstellung der Aktion die Spannung-empfindlichen fluoreszierenden Proteins VSFP-CR gezeigt wird. Auf die Depolarisation der Zellmembran übersetzt eine strukturelle Neuordnung in der Spannung-sensing transmembrane Domäne in eine Neuorientierung des grünen (GFP) und rot (RFP) fluoreszierendes Protein, Steigerung der Effizienz der intramolekularen Förster Resonanz Energietransfer (FRET). (B) die Emission-Spektren von VSFP auf Anregung von der GFP in Zellen an die Membran-Ruhepotential (obere Abdeckung) und depolarisiert Zellen (untere Leiste) werden dargestellt. Die spektrale Änderung nach Depolarisation ist zur Verdeutlichung übertrieben dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Die Veränderungen in der FRET-Effizienz spiegeln die Schwankungen des Membranpotentials sind abgebildet mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgerüstet mit einer Bild-Splitter, die roten und grünen Fluoreszenz Emissionen trennt und projiziert sie auf zwei angrenzenden Gebieten der der Chip einer Kamera sCMOS (Abbildung 2). Mit diesem Set-up kann die Fluoreszenz-Emission bei zwei verschiedenen Wellenlängen Bands gleichzeitig ermöglicht die Berechnung des Verhältnisses der rot-grünen Fluoreszenz entsprechend das Membranpotential in jedem Bild eine Zeitraffer-Serie aufgezeichnet werden.
Abbildung 2: Konfiguration des das Abbildungssystem. Die Hauptkomponenten des imaging-System verwendet, um Bild, das die spektrale Veränderungen der Spannung-empfindlichen fluoreszierenden Proteins spiegeln die Membran mögliche Veränderungen mit einer hohen zeitlichen Auflösung dargestellt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Der Ausdruck der VSFP-CR im CMs wird durch Lentivirale Transduktion erreicht. Interessenbekundung für die CM-Subtyp direkt, enthält die Lentivirus ein Promotor-Element ( MLC2v -Enhancer), das speziell Transkription in ventrikuläre wie iPSC-CMs10fährt. Wenn das iPSC-CMs, die eine Mischung von Vorhofflimmern-ähnliche, nodal-ähnliche und ventrikuläre-wie Zellen darstellen mit diesem Lentivirus ausgestrahlt werden, wird VSFP-CR nur in den linksventrikulären-ähnliche Zellen ausgedrückt. Da die optische Aktionspotential Bildgebung von fluoreszierenden Sensor abhängt, vertreten die aufgezeichneten Aktionspotentiale ausschließlich den CM-Untertyp von Interesse (Abbildung 3).
Abbildung 3: Projektträger-gesteuerte VSFP Ausdruck für potenzielle Bildgebung Subtyp-spezifischen Membran. (ein) dieses Schema zeigt, wie Cardiomyocyte Subtyp-spezifische optische Aktionspotential Aufnahmen erreicht werden. (b) iPSC-CMs mit einem VSFP unter der Kontrolle der ventrikulären-spezifische MLC2v-Enhancer infiziert werden angezeigt. Der Ausdruck von der Spannungssensor ist nur in ventrikuläre-ähnlichen CMs in der GFP-Kanal (links) beobachtet. Die Phasenkontrast (Mitte Platte) und Overlay-Bild (Rechte Abbildung) sind ebenfalls vorhanden. Die weiße gepunktete Linien markieren Zellgrenzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vorbereitung des iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten für Imaging
Hinweis: Methoden für iPSC Kultur und kardialen Differenzierung vor12,13,14 veröffentlicht worden und werden hier nicht ausführlich diskutiert. Die Reinigung des iPSC-CMs durch manuelle Mikrodissektion, magnetische Zellseparation oder Laktat-Auswahl wird empfohlen, je nach Differenzierung Protokoll verwendet. Für das folgende Protokoll waren Microdissected Explantaten aus schlagen Bereiche generiert anhand einer Monoschicht Differenzierung Protokoll13, am Tag 15 der kardialen Differenzierung und kultiviert bis 30. Tag auf Fibronektin-beschichteten Platten wie beschrieben vor10.
- Nehmen Sie die Zelle Kultur Platten aus dem Inkubator und sammeln Sie manuell die kardiale Explantaten in Mikrozentrifugenröhrchen mit einer 200 µL Pipette. Nach der Sedimentation, Aspirieren die Zellkultur überstand und vorsichtig waschen der Explantate 2 X mit Hank ist ausgewogen Salz Lösung (HBSS).
- IPSC-CMs zu trennen, durch Zugabe von Kollagenase Typ II (430 U/mL in HBSS) und inkubieren sie bei 37 ° C für 30 Minuten.
- Nachdem die Sedimentation der verbleibenden großzellige Horste, sammeln des Überstands, der die dissoziierten einzelne iPSC-CMs enthält und fügen Sie diese auf frisches CM Wartung Medium mit einer hohen fetalen bovine (FBS) Serumkonzentration (DMEM-F12, 20 % FBS, 2 mM L-Glutamine, 1: 100 MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin und 0,1 mM β-Mercaptoethanol).
- Wiederholen Sie die Dissoziation, wenn großzellige Klumpen bleiben. Sammeln single iPSC-CMs durch Zentrifugation und Aufschwemmen sie in CM Medium mit einer niedrigen Konzentration des FBS (2 % FBS).
- Neu Säen Sie einzelne iPSC-CMs in eine Dichte, so dass die nachfolgende Darstellung der Einzelzellen auf eine 3,5 cm Glasboden Zelle Kultur Microdish, die mit Fibronektin (2 µg/cm2) überzogen wurde. Die Aussaatdichte vor der Aufnahme im Hochdurchsatz-Experimente zu optimieren. In der Regel sind 5 – 10 kardiale Explantaten pro 3,5 cm Schüssel ausreichend; Allerdings hängt dies stark von modellabhängigen Größe und Reinheit.
- Kultur der einzelnen iPSC-CMs nach ihrer Dissoziation in CM Wartung Speichermedium mit 2 % FBS für mindestens 48 h um eine ausreichende Erholung zu gewährleisten.
Hinweis: In den nächsten Schritten werden die iPSC-CMs mit einem Lentivirus Codierung der GEVI VSFP-CR unter der Kontrolle einer MLC2v Enhancer10 um eine ventrikuläre-spezifische GEVI Ausdruck zu erreichen ausgestrahlt. Alternativ kann Lentivirale Konstrukte ermöglichen die GEVI speziell in Knoten oder Vorhofflimmern wie Zellen auszudrücken oder eine unspezifische Konstrukt beherbergen ubiquitär ausgedrückt PGK-Promotor, gebrauchte10. Lentivirale Plasmide sind auf Anfrage erhältlich.
Achtung: Beim Arbeiten mit Lentivirale Partikel sicherstellen Sie, dass die Arbeitsumgebung die angemessene Sicherheitsstufe, die Sicherheitshinweise hat für die Arbeit mit potentiell infektiösen Erregern, und einhalten der notwendigen Sicherheitsvorkehrungen. - Bereiten Sie die Infektion Medium durch Mischen Lentivirus10-mit Zellkultur überstand, der in HEK293 Zellen hergestellt wurde wie vor15, mit CMs Wartung Medium beschrieben (siehe Punkt 1.3) im Verhältnis 1:1.
- Fügen Sie Hexadimethrine Bromid an eine Endkonzentration von 8 µg/mL, die Infektion-Effizienz zu erhöhen.
Hinweis: Aufgrund der hohen Infektion ist Effizienz der iPSC-CMs vorherige Konzentration von Lentivirus durch Ultrazentrifugation normalerweise nicht notwendig. - Aspirieren Sie CM Wartung Medium aus dem einzigen iPSC-CMs und ersetzen Sie es mit der Infektion Medium während Schritte 1.7 und 1.8 vorbereitet. Kultur der infizierten einzelne iPSC-CMs Infektion mittelfristig für 12 h bei 37 ° C. Dann Aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie es wieder mit CM Wartung Medium.
Hinweis: Ein Fluoreszenzsignal aus dem GEVI wird 48 Stunden nach der Infektion. Eine Bildgebung der Membran möglichen Aufnahmen, 72 h nach der Infektion zum frühestmöglichen Zeitpunkt, empfiehlt sich eine richtige Signalstärke zu gewährleisten. Einzelne infizierte iPSC-CMs können für mindestens 3 Wochen kultiviert und sequenziell abgebildet werden. Wenn umfangreiche Immunofluoreszenz während einer bildgebenden Sitzung auftritt, gewinnt das Fluoreszenzsignal im Laufe der Zeit. - Vor Bildgebung, tauschen die Zellkulturmedium Tyrode Lösung ergänzt mit Ca2 + (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM Glukose, 1,8 mM CaCl2und 10 mM HEPES; pH 7,35).
2. optische Membran mögliche Aufnahmen
- Ort der bildgebenden Kammer mit dem iPSC-CMs auf der Bühne von einem umgekehrten Epifluoreszenz Mikroskop ausgestattet mit einen Bild-Splitter, die entsprechenden Filter-Sets und eine Kamera (z.B. eine sCMOS Kamera) in der Lage, Hochgeschwindigkeitsaufnahmen auf hohem Empfindlichkeit.
Hinweis: Z. B. Anwendung eine 480/40 nm Bandpass-Anregung zu Filtern in Kombination mit einem 500 nm lang-Pass dichroitischen Spiegel im Mikroskop, und 568 nm lang-Pass dichroitischen Spiegel kombiniert mit 520/28 nm und 630/75 nm Emission Bandpassfiltern in der Bild-Splitter. Für Single-Cell Imaging bietet eine hohe Vergrößerung, hoher numerischer Apertur Öl eintauchen Ziel das beste Signal-Rausch-Verhältnis. - Wenn elektrische Stimulation erforderlich ist, installieren Sie Tempo Elektroden in der bildgebenden Kammer und verbinden Sie diese mit einem Impuls-Generator.
Hinweis: Wir verwendet ein Tempo eingelassen, die enthalten zwei Platinelektroden und ausgestattet in die 3,5 cm Glasboden Zelle Kultur Gerichte. Die Zellen befindet sich zwischen den Elektroden wurden abgebildet. Typische Tempo Kennwerte sind rechteckige Impulse von 5 ms Dauer, mit einer Amplitude von 10 V/cm Elektrodenabstand. - Optional, verwenden Sie eine beheizte Mikroskoptisch, um eine gleichbleibende Temperatur des iPSC-CMs während Bildgebung oder sogar ein Mikroskop Inkubation Kammer Aufbau zu gewährleisten, wenn langfristige Bildgebung werden soll.
- Bringen Sie die Zellen, sich zu konzentrieren und platzieren Sie eine Zelle mit dem Ausdruck der GEVI in der Mitte des Feldes anzeigen zu.
Hinweis: Dies geschieht am einfachsten durch Verwendung der Okulare des Mikroskops mit einem grün fluoreszierendes Protein (GFP) oder ein rotes fluoreszierendes Protein (RFP) Filter setzen, um mit dem Ausdruck der GEVI Zellen zu identifizieren. - Den Strahlengang so eingerichtet dass abgestrahlten Lichts in den Bild-Splitter weitergeleitet wird. Wechseln Sie die Filter-Cube im Mikroskop zu derjenige, der mit den Filtern in der Bild-Splitter kombiniert werden (siehe Tabelle der Materialien).
- In der Steuerung der Kamera-Software die Übernahme-Einstellungen so eingerichtet dass Hochgeschwindigkeitsaufnahmen (z.B. 100 Bilder pro Sekunde, bei einer Belichtungszeit von 10 ms pro Frame) möglich ist.
Hinweis: In der Regel, dies beinhaltet das binning Kamerapixel (z.B.8 x 8 Pixel von den Kamerachip sind Makulatur um ein Pixel im Zeitraffer Film zu erzeugen). - Richten Sie die Bild-Splitter nach Anweisungen des Herstellers. Die beiden Bilder repräsentieren die zwei verschiedenen Emission Wellenlänge Bands sollten nebeneinander, jeweils einer Hälfte des Bildes.
Hinweis: Dieser Schritt muss nur 1 X am Anfang jeder bildgebenden Sitzung durchgeführt. - Überprüfen Sie und, falls erforderlich, stellen Sie den Fokus des Bildes von der Kamera.
- Passt die Helligkeit der Beleuchtung Licht, so dass Sättigung der Pixel vermieden wird; Dies kann am einfachsten mithilfe einer Farbpalette in der gesättigten Pixel durch eine einzigartige Farbe dargestellt sind.
Hinweis: Bei diesen Vorbereitungen vor der Bildgebung, die Exposition der Probe, das Anregungslicht auf das notwendige Maß (d. h.nicht verlassen das Licht auf für Zeiträume längere) begrenzen, Immunofluoreszenz die GEVI zu vermeiden. - Richten Sie die Übernahme der Zeitreihe (z.B., 5.000 Bilder mit 100 Bildern pro Sekunde für die Dauer einer Serie von 50 s). Dimmen Sie das Licht im Raum (einschließlich Computer-Monitore) zur Vermeidung von Streulicht die Messung beeinflussen. Wenn die Erregung Lichtblende nicht durch die imaging-Software gesteuert wird, öffnen sie vor dem Starten der Übernahme.
- Die Übernahme der Bildserie zu starten. Wenn elektrische Stimulation gewünscht wird, starten Sie die Tempo Sequenz zum geeigneten Zeitpunkt, es sei denn, sie automatisch von der Software zur Abbilderstellung eingeleitet wird. Wenn die Anwendung eines pharmakologischen Wirkstoffs gewünscht ist, tun dies entweder manuell (z. B.durch den Agenten in einer zehnfachen Ende Konzentration der Aufnahme Kammer mit 900 µL Puffer, und mischen Sie es vorsichtig mit der Pipette pipettieren 100 µL) oder mithilfe einer konstant-Flow Perfusion System.
- Nach Abschluss die Übernahme schließen Sie der Erregung Lichtblende bei Bedarf. Speichern Sie die Aufnahme auf die Festplatte.
- Verlassen die Aufnahmeeinstellungen (d.h., Belichtungszeit, Frame-Rate und Intensität des Lichts) unverändert, führen Sie eine Aufzeichnung der Hintergrundfluoreszenz (wie in Schritt 2.11) über einer Region das Deckglas nicht mit Zellen oder über ein anderes Deckglas auf dem nicht Zellen haben gesät.
Hinweis: Wenn sequentielle Messungen durchgeführt werden, ohne die Übernahme-Einstellungen zu ändern, ist nur eine Aufzeichnung im Hintergrund Fluoreszenz für diese Messungen erforderlich. - Falls gewünscht, durchführen Sie zusätzliche Experimente (Schritte 2.4 – 2.13) auf verschiedenen iPSC-CMs befindet sich auf der gleichen Deckglas. Beachten Sie, dass alle CMs auf dem Deckglas betroffen sein werden, für den Fall, dass ein Medikament angewendet wurde.
3. Analyse
> Hinweis: Abhängig von der imaging-Software verwendet (das ist in der Regel eine proprietäre Software-Paket zur Verfügung gestellt durch den Hersteller der Kamera oder die ganze Fluoreszenz-imaging-System), es kann möglich sein, führen Sie die Analyse der erworbenen Bilder teilweise oder sogar vollständig innerhalb dieses Software-Paket. Jedoch hier ein Workflow der Bildanalyse, die mit ausgeführt werden können Open Source Software open (d. h., die Bild-Analyseplattform ImageJ)16, die bequem installiert werden kann, verwenden eine Distribution wie Fidschi17und das R-Paket für statistischen computing18 werden beschrieben. Kurz, Regionen von Interesse (ROIs), die Zellen oder Hintergrund darstellen ImageJ gezeichnet, und die mittlere Fluoreszenz in diese ROIs im Laufe der Zeit in eine Datei, dann weiter in R oder alternativ mit Tabellenkalkulations-Software analysiert werden, exportiert.
- In der imaging-Software speichern Sie oder exportieren Sie die erfasste Bild-Zeitreihen (die Aufnahme der Zellen und die entsprechende Aufzeichnung im Hintergrund) in einem Format (z.B.TIF), die von ImageJ gelesen werden kann. Alternativ können Sie das BioFormats-Plugin (https://imagej.net/Bio-Formats), bietet Routinen ermöglicht ImageJ, verschiedene Marken von imaging Systemhersteller proprietäre Dateiformate herauszulesen.
Hinweis: Die folgenden Schritte davon ausgehen, dass die bildgebenden Intervalle während der Aufnahme sind. Wenn dies nicht der Fall ist, ist es möglicherweise erforderlich, die Timing-Informationen aus der imaging-Software exportieren und in der weiteren Analyse aufnehmen. - Öffnen Sie die TIF-Stack enthält die Zellen in ImageJ.
- Verwenden Sie das Freihand-Auswahl-Werkzeug, um einen ROI über eine fluoreszierende Cardiomyocyte im roten Kanal zeichnen. Stellen Sie sicher, dass der ROI groß genug ist, so dass die Zelle nicht aus der ROI beim Auftraggeber bewegt.
- Öffnen Sie die ROI-Manager-Plugin ("analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager') und drücken Sie die Schaltfläche "Hinzufügen [t]" diese ROI als ROI1 hinzufügen.
- Ziehen Sie den ROI über dieselbe Zelle in den grün-Kanal und fügen Sie diese ROI als ROI2.
- In der "analysieren | Set Messungen Menü, deaktivieren Sie alle Optionen außer "Grauwert zu verstehen".
Hinweis: Dies muss nur 1 X in einer ImageJ-Sitzung durchgeführt werden. - Drücken Sie in der ROI-Manager, der "mehr | Multi-Maßnahme " Taste. Wählen Sie die Optionen "Maßnahme alle Slices" und "Eine Zeile pro Stück" und drücken Sie "OK". Es öffnet sich ein Fenster mit einer Tabelle mit drei Zeilen (die Slice-Nummer und die mittlere Fluoreszenz in repräsentieren die Zelle in den roten Zahlen und in den grünen Kanal, jeweils zwei ROIs).
- Verwendung "Datei | Speichern unter , die Kalkulationstabelle in eine durch Kommas getrennten Wert (CSV) Datei speichern.
- Schließen Sie das Fenster mit dem Bild-Stack und die Tabelle ohne die ROI-Manager-Fenster zu schließen. Öffnen Sie die TIF Bildstapels mit Hintergrundmessung.
- Drücken Sie in der ROI-Manager, der "mehr | Multi-Maßnahme' -Taste. Wählen Sie die Optionen "Maßnahme alle Slices" und "Eine Zeile pro Stück" und drücken Sie "OK".
- Verwendung "Datei | Speichern unter , die Tabelle mit den Hintergrunddaten in eine andere CSV-Datei zu speichern.
Hinweis: Die folgenden Berechnungen können mit Tabellenkalkulations-Software erfolgen. Wir nutzten die R Software18. Eine einfaches Beispiel-Skript, die liest die Zelle und Hintergrund Daten aus den Dateien "cell.csv" und "background.csv" führt die Berechnungen und Grundstücke den zeitlichen Verlauf der Membran mögliches Signal wird als zusätzlicher Code Datei 1bereitgestellt. - Berechnen Sie von der Aufzeichnung im Hintergrund die durchschnittliche Intensität in den roten und den grünen Kanal. Ziehen Sie diese Hintergrundsignal aus den Signalen aus der Zelle in den roten und grünen Kanal Hintergrund korrigiert RFP berechnen und GFP Signale bzw. ab.
- Als Ersatz für das Membranpotential berechnen Sie das Verhältnis RFP/GFP.
Hinweis: Dieses Verhältnis ist dimensionslos. Alternativ kann es auf seinen ursprünglichen Wert (d.h., ΔR/R0) normalisiert werden. Wichtig ist, enthält nützlicher Informationen in die zeitlichen Veränderungen nicht in die absoluten Werte der dieses Verhältnis. Aufgrund der unebenen Immunofluoreszenz der GFP und der RFP kann eine Baseline Drift in diesem Verhältnis auftreten. Bei Bedarf kann solch eine Baseline Drift mit dem Bau einer Grundlinie Kurve und Abzug von RFP/GLP-Verhältnis10berichtigt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In Abbildung 4aist eine repräsentative einzelne iPSC-CM mit den weißen gestrichelten Linien markieren den ROI bei der bildgebenden Analyse in die RFP (linke Seite) und der GFP (Rechte Seite) Kanal gezogen dargestellt. Das Signal aus dem RFP-Kanal zeigt eine regelmäßige Erhöhung in Fluoreszenz Intensität während jedes Aktionspotential (Abbildung 4 b, obere Leiste). Wie in der Einleitung beschrieben, ist dies auf eine zunehmende Bund verursacht durch Änderungen im Membranpotential (Abbildung 1). Übereinstimmend, zeigt das GFP-Signal eine periodische Abnahme der Fluoreszenz Intensität (Abbildung 4 b, mittleren Bereich). Das RFP/GLP-Verhältnis (Abbildung 4 b, unten) ist das biologische Signal in nachgeschalteten Analysen, z. B. APD50 und APD90 Messungen verwendet. Mit Hilfe dieser Methode, die 30 Tage alten ventrikuläre wie iPSC-CMs Tempo bei 0,5 Hz ergab einen Mittelwert APD50 (die Dauer vom Beginn des Aktionspotentials bis die Repolarisation um 50 % abgeschlossen ist) 439 ms (± 46 ms) und einem Mittelwert APD90 (die Dauer bis die Repolarisation durch 90 % abgeschlossen) von 520 ms (± 47 ms) (Abb. 4 c).
Abbildung 4: Prinzipien der Bildanalyse und grundlegende Aktionspotential Merkmale. (ein) das gleichzeitig aufgezeichnete RFP (rechts) und GLP (linke Seite) Fluoreszenz eines einzigen iPSC-cm wird angezeigt. Die weiße gepunktete Linien repräsentieren die Regionen von Interesse (ROI) für die bildgebende Analyse verwendet. (b) Raw Spuren von Hintergrund-korrigierte RFP, GLP, und RFP/GLP-Signale von den ROI abgeleitet werden angezeigt. (c) die Mittel und SEM der APD90 und APD50 einzelne ventrikuläre wie iPSC-CMS bei Raumtemperatur und mit 0,5 Hz Tempo gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Um zu demonstrieren, dass die Methode auch in der Lage, Änderungen in der Dauer des Aktionspotentials zu erfassen, wurden iPSC-CMs elektrisch stimuliert, bei zunehmender Anregung Preise von 0,4 bis 2,5 Hz, Erhöhung der Rate alle fünf Takte (Abbildung 5). Abbildung 5azeigt ein typische optisch aufgezeichnet Membran mögliches Signal aus einem iPSC-CM. Die ersten vier Aktionspotentiale mit jedem schlagen Rate wurden gemittelt und demonstrieren eine progressive Verkürzung von Aktionspotentialen Preisen erhöhte schlagen (Abbildung 5 b). Averaging anschließende rasante Beats ist eine wirksame Methode zur Verringerung der Lärm, die optisch aufgezeichnet Aktionspotentiale10. Es sollte erwähnt werden, dass die dargestellte Experiment nicht, den vollen Betrag der Rate-abhängige Aktionspotential Verkürzung möglich erfassen könnte, angesichts der Tatsache, dass wir die Zelle für nur 5 Schläge in jedem Tempo Tempo,, die möglicherweise nicht ausreichend Tempo, um Gleichgewicht zu erreichen.
Abbildung 5: Auswirkungen der Tempo-Frequenz auf die Dauer des Aktionspotentials. (ein) Eine iPSC-CM war gemütlich auf die Erhöhung der Frequenzen von 0,4 bis hin zu 2,5 Hz wie angegeben (die einzigen Tempo Stromimpulse werden durch Pfeile dargestellt). (b) für jedes Tempo Frequenz wurde ein gemittelte AP aus der ersten vier APs bei dieser Frequenz berechnet. Als Overlay, demonstrieren die AP mit zunehmendem Tempo Preise Verkürzung der gemittelten APs dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Die Methode kann auch verwendet werden, zu untersuchen, elektrophysiologische Auswirkungen von Drogen auf das iPSC-CMs (Abbildung 6) angewendet. Hier wurde Isoproterenol, einen nicht-selektiven β-Adrenoreceptor-Agonisten auf spontan-schlagende iPSC-CMs angewendet, wie angegeben, führt zu einer prompten Anstieg schlagen (Abb. 6a). Eine Dosis-Wirkungs-Kurve, die den Effekt von Isoproterenol-Konzentrationen über die Prügel-Häufigkeit der iPSC-CMs ist in Abbildung 6dargestellt.
Abbildung 6: Effekt von Isoproterenol auf der Frequenz schlagen. (ein) die repräsentative roh optische Aktionspotential Rückverfolgung von spontan-Prügel einzelne iPSC-CM wird angezeigt. IPSC-CMs wurde Isoproterenol (mit einer Endkonzentration von 1 µM) hinzugefügt, da durch die Leiste angezeigt. (b) diese Dosis-Wirkungs-Kurve zeigt den Effekt der verschiedenen Isoproterenol Konzentrationen über die Prügel-Häufigkeit der iPSC-CMs Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine optische Aufnahme von APs aus ein bestimmten Subtyp (z.B. ventrikuläre-wie Zellen) des CMs generiert aus menschlichen iPSCs. Menschlichen iPSC-CMs sind eine aufstrebende Werkzeug, eine Vielzahl von biologischen und medizinischen Probleme anzugehen, und die Differenzierung zu CM-Subtypen ist eine wichtige Quelle für experimentelle Variabilität. Mithilfe von spezifischen Promotor Elemente wird der Ausdruck einer GEVI speziell im CMs repräsentieren den Untertyp des Interesses, erreicht dann optisch abgebildet werden.
Die erfolgreiche Übernahme von APs aus einzelnen iPSC-CMs hängt von dem Seeding Dichte nach der Dissoziation. Wenn die Zellen zu dicht eingesät werden, ist es isoliert einzelne iPSC-CMs zu finden, die nicht Bestandteil einer elektrischen synzytien sind zeitaufwändig. Zu geringe seeding dichten beeinträchtigt das Überleben der Zellen. So wird eine systematische Erprobung unterschiedlicher Dichte Aussaat empfohlen, vor allem vor der Aufnahme in Experimenten, die auf Hochdurchsatz-Bildgebung angewiesen sind.
Die VSFP durchläuft während der Bildaufnahme Immunofluoreszenz, welche das Signal-Rausch-Verhältnis, vor allem bei längeren Experimenten beeinflussen könnte. Wenn schnelle Immunofluoreszenz während des Experiments vorhanden ist, stellen Sie sicher, dass die Erregung Lichtblende nur geöffnet ist, während der Bildaufnahme oder notwendigen Vorbereitungsschritte (suchen und mit Schwerpunkt auf VSFP exprimierenden Zellen), die sein sollte so schnell wie möglich durchgeführt. Darüber hinaus reduzieren Sie die Leistung von das Anregungslicht auf die minimale Menge notwendig und machen den Dynamikbereich der Kamera hohe Empfindlichkeit für die Bildaufnahme nutzen.
Wenn Sie den ROI bei der Bildanalyse zeichnen, beachten Sie, dass iPSC-CMs während der Kontraktion bewegen und innerhalb des ROI in allen Bildern des Stapels Bild bleiben sollte. Ratiometrischen aufgrund der VSFP jede Bewegung der Zelle aus der ROI führt nicht zur künstlichen Signale aber die Signalqualität negativ beeinflussen könnte. Jedoch ROIs, die zu groß sind und unnötig große nicht Signal-produzierenden Bereichen auch negativ beeinflussen das Signal-Rausch-Verhältnis und sollte vermieden werden.
Für die Vertreter Ergebnissedifferenziert iPSC-CMs, die sich reift für mindestens 30 Tage, nachdem eine kardiale Induktion gedient haben konnten. Nach Ablauf dieser Frist der Reifung, verschiedene CM Subtypen, wie z. B. nodal-, Vorhofflimmern-, oder ventrikuläre-wie Zellen unterschieden werden. Diese Zellen sind noch nicht ausgereift und nur eine embryonale-ähnlichen Phänotyp in zweidimensionalen (2D) Kultur Systeme beeinflussen elektrische Eigenschaften sowie Calcium Umgang mit19zu erreichen. Diese allgemeine Einschränkungen des iPSC-CMs berücksichtigt werden müssen, da sie experimentelle Ergebnisse unabhängig von der Methode verwendet zur Messung der Aktionspotentiale verwirren können. Erweiterte dreidimensionale (3D) Kultur-Systeme haben viel versprechende Ergebnisse zur weiteren Reifung20gezeigt, und die hier beschriebene Methode könnte in diesem Zusammenhang wertvoll sein.
Aktuelle Goldstandard für die Messung APs der iPSC-CMs ist Patch Clamp Aufnahmen, die eine sehr detaillierte Analyse der unterschiedlichen AP Eigenschaften erlauben und sogar ermöglicht Messung einzelner Ionen-Kanal Ströme. Darüber hinaus kann die Absolutwerte (z.B., die ruhenden Membranpotential) gemessen werden. Im Gegensatz dazu basieren optische AP Aufnahmen auf relative Änderung des Membranpotentials. Aufgrund der relativ langsamen intrinsische Kinetik von der VSFP bestimmten AP-Eigenschaften, wie die "Überschwingen", könnte aus den Lesungen abgestumpft, und eine sinnvolle Quantifizierung schnell Funktionen, wie die AP-Aufschlag-Geschwindigkeit ist nicht möglich. In einem typischen Versuchsaufbau werden nicht die absoluten Werte, sondern Unterschiede in den Werten (z.B.zwischen verschiedenen Zelllinien oder vor und nach der Anwendung eines Arzneimittels) gemessen. Dies kann mit der optischen Methode beschrieben in diesem Manuskript für Merkmale wie AP-Dauer zuverlässig erreicht werden (z. B. APD90 oder APD50) oder schlagen, mit einem viel höheren Durchsatz im Vergleich zu Patch Clamp10 . Darüber hinaus ermöglicht die nicht-invasive Art dieser Technologie mehrere Messungen der gleichen Zelle über Zeit10. So sollte optische AP Aufnahmen und Patch-Clamp als ergänzende Instrumente betrachtet und verwendet, je nachdem die experimentelle Frage, die beantwortet werden muss.
Optische AP Aufnahmen können der Ausdruck von einem GEVI oder durch die Anwendung einer Potentiometrische Fluoreszenzfarbstoff (z.B. di-8-ANEPPs)21erreicht werden. Die fluoreszierende Farbstoffe haben in der Regel günstigeren Fluoreszenz Kinetik aber können nicht auf einen bestimmten Untertyp von Kardiomyozyten gerichtet werden, da sie nicht genetisch-kodiert sind. Eine Reihe von GEVIs basierend auf unterschiedlichen Funktionsprinzipien wurden entwickelten22. Hier wird der Bund GEVI VSFP-CR-11 verwendet. Der Hauptgrund für diese Entscheidung war die ratiometrischen Natur dieser Indikator, der auf zellulärer Depolarisation mit einer Zunahme der roten und einen Rückgang der grünen Fluoreszenz reagiert, wenn das grüne fluoreszierende Protein angeregt wird. Dies ist vorteilhaft im Bereich der Kardiologie, weil solch ein ratiometrischen Indikator weniger anfällig für Artefakte verursacht durch Zellbewegungen durch Kontraktionen der Herzmuskelzellen als Indikatoren, die ist auf nur durch eine Änderung des depolarization reagieren ihre Fluoreszenzintensität.
Während nur Ergebnisse aus Experimenten targeting ventrikuläre wie iPSC-CMs mit der MLC2v -Enhancer hier präsentiert werden, kann auch auf Vorhofflimmern oder nodal-wie mit anderen Subtyp-spezifischen Promotor Elemente10CMs. Um das Verfahren im Detail zu beschreiben, dieses Manuskript Schwerpunkt Bildgebung einzelner iPSC-CMs, die auf einem deckgläschen Glas ausgesät wurde, da dies die Analyse von AP Eigenschaften einzelner Zellen ermöglicht und die höchste Signal-Rausch-Verhältnis bietet. Diese Technologie ermöglicht jedoch auch die Bildgebung des CMs, die mit anderen Zellen in eine elektrische synzytien oder eine 3-d-Struktur integriert sind. Dies ist von besonderem Interesse, wie 3-d-Zelle Kultur Modelle immer häufiger eingesetzt werden und gezeigt haben, dass 2-D-Modelle20andere Eigenschaften zur Verfügung zu stellen. Je nach den bildgebenden auf- und die Definition des ROIs können optische Signale von größeren Flächen des 3-d-Gewebes oder aus einzelnen Zellen im Gewebe analysiert werden. Darüber hinaus können mehrere Zellen gleichzeitig abgebildet und separat analysiert führt zu einer erheblichen Steigerung des Durchsatzes.
Zusammengenommen kann die hier vorgestellte Methode die Anwendbarkeit der iPSC-CMs auf dem Gebiet der Arrhythmie Forschung Erleichterungen, indem die schnelle optische Phänotypisierung von iPSC-CMs für Arrhythmie-bezogene Phänotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Si 1747/1-1), die Else Kröner-Fresenius-Stiftung und der Deutschen Stiftung Für Herzforschung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
- Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research. Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).
- Rocchetti, M., et al. Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).
- Sinnecker, D., et al. Modeling long-QT syndromes with iPS cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).
- Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art. Life Sciences. , 98-113 (2016).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Den Hartogh, S. C., Passier, R. Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity. Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).
- Schweizer, P. A., et al. Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229 (2017).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Chen, Z., et al. Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes. European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2008).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).
- Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scientific Reports. 7, 5464 (2017).
- Dorn, T., et al. Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity. Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).
- Kaestner, L., et al. Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).
