Summary
Hier presenteren we een methode om optisch beeld actie potentieel, specifiek in ventriculaire-achtige geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige cardiomyocytes. De methode is gebaseerd op de promotor-gedreven uitdrukking van een spanning-gevoelige fluorescent proteïne.
Abstract
Cardiomyocytes gegenereerd op basis van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-CMs) zijn een opkomende hulpmiddel bij cardiovasculair onderzoek. In plaats van een homogene bevolking van cellen, de iPSC-CMs gegenereerd door huidige differentiatie protocollen vertegenwoordigen een mengsel van cellen met ventriculaire-, atriale-, en knooppunten-achtige fenotypen, die compliceert fenotypische analyses. Hier, wordt een methode om optisch record actie potentials specifiek van ventriculaire-achtige iPSC-CMs gepresenteerd. Dit wordt bereikt door lentivirale transductie met een constructie waarin een genetisch-gecodeerde voltage-indicator onder de controle van een ventriculaire-specifieke promotor-element is. Wanneer iPSC-CMs zijn getransduceerde met deze constructie, wordt de voltage-sensor uitgedrukt uitsluitend in ventriculaire-achtige cellen, waardoor potentiële opnames subtype-specifieke optische membraan met behulp van time-lapse fluorescentie microscopie.
Introduction
Cardiomyocytes (CMs) afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn een opkomende hulpmiddel om te ontleden van moleculaire mechanismen van hart-en vaatziekten, onderzoeken van nieuwe therapieën, en scherm voor bijwerkingen van geneesmiddelen cardiale effecten1,2 ,3. Vanaf het begin zijn arrhythmogenic ziekten zoals channelopathies een belangrijk aandachtspunt van dit onderzoek gebied4. Daarom zijn de methoden te onderzoeken elektrische fenotypes van CMs, zoals hartritmestoornissen of veranderingen in actiepotentiaal (AP) morphologies, in het hart van deze technologie.
Een belangrijke overweging bij de toepassing van iPSC-CMs is dat huidige cardiale differentiatie protocollen niet leiden een homogene bevolking van cellen tot. Integendeel, ze zijn eerder een mengsel van cellen die lijkt op de sinusknoop, atriale, en ventriculaire CMs op verschillende niveaus van rijping5,,6,,7,8. Deze heterogeniteit kunnen een relevante bron van experimentele variabiliteit, vooral als parameters zoals AP duur (APD) worden onderzocht, die intrinsiek verschillen tussen CM subtypen (bijvoorbeeldde APD is korter in atriale dan in ventriculaire CMs). De conventionele aanpak van dit probleem is te onderzoeken enkele iPSC-CMs met behulp van de methode van de klem patch en classificeren van elke cel als knooppunten-, atriale-, of ventriculaire-achtige, gebaseerd op de AP morfologie9. Een latere analyse kan vervolgens worden beperkt tot de cellen vertegenwoordigt het CM-subtype van belang. Het grote nadeel van deze strategie is de beperkte gegevensdoorvoer en de afwezigheid van schaalbaarheid. Het invasieve karakter van patch klem electrofysiologie staat bovendien geen de beeldvorming van dezelfde cellen sequentieel over langere tijd.
Wij bieden hier, experimentele details op een10 van de methode ontwikkeld om het beeld optisch APs in specifieke subtypen van iPSC-CMs. Dit overwint het probleem van de subtype heterogeniteit en drastisch verhoogt de doorvoer in vergelijking met conventionele methoden, zodat de snelle fenotypering voor iPSC-CMs uitvoering van genetische varianten of worden blootgesteld aan farmacologische agenten.
Overzicht van de subtype-specifieke optische beeldvorming aanpak
Een genetisch-gecodeerde voltage indicator (GEVI), waarvan fluorescentie-eigenschappen op de depolarisatie en repolarisatie van de celmembraan wijzigen, wordt gebruikt om het beeld optisch veranderingen van het membraanpotentiaal van CMs. De hier toegepast GEVI is de spanning detecterende fluorescent proteïne VSFP-CR11, die uit een spanning-sensing transmembraan domein gesmolten aan een combinatie van een groene (klaver) en een rode (mRuby2) TL proteïne (figuur 1A bestaat). Als gevolg van de nabijheid van de twee fluorophores, de excitatie van de groen fluorescente proteïne in een fractie van de energie van de excitatie worden overgebracht naar de rode fluorescerende eiwit via Förster resonance energy transfer (FRET) resultaten. Daarom is de excitatie van de groen fluorescente proteïne resulteert in een emissie van zowel de groene en de rode fluorescerende eiwitten (figuur 1A, bovenste deelvenster). Wanneer de cel depolarizes, een structurele omlegging van de voltage-sensor gebeurt dat vertaalt zich in een heroriëntering van de twee fluorescente proteïnen, verhoging van de efficiëntie van de FRET. Dus wordt nog meer van de excitatie-energie overgebracht van het groen aan de rode fluorescente proteïne (figuur 1A, lagere paneel). Dientengevolge, in een depolarized cel, de uitstoot van groene fluorescentie is minder scherp, en de rode fluorescentie-emissie is helderder dan in een cel in rust membraanpotentiaal (figuur 1B).
Figuur 1: optische beeldvorming van de membraanpotentiaal met VSFP-CR. (A) A schematische voorstelling afgebeeld van de actie van de spanning-gevoelige fluorescent proteïne DIE VSFP-CR wordt weergegeven. Bij de depolarisatie van de celmembraan, een structurele herschikking in het spanning-sensing transmembraan domein vertaalt zich in een heroriëntering van de groene (GFP) en rode (RFP) TL proteïne, verhoging van de efficiëntie van de intramoleculaire Förster resonance energy transfer (FRET). (B) de emissie spectra van een VSFP op de excitatie van de GFP in cellen bij de rustpotentiaal membraan (bovenste deelvenster) en depolarized cellen (lagere paneel) worden afgebeeld. De spectrale verandering op depolarisatie is overdreven voor de duidelijkheid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De veranderingen in de efficiëntie van de FRET spiegeling van de schommelingen van de membraanpotentiaal zijn beeld met behulp van een fluorescentie Microscoop voorzien van een afbeelding splitter, die scheidt van de rode en groene fluorescentie emissies en projecteert ze op twee aangrenzende gebieden van de chip van een sCMOS camera (Figuur 2). Met deze set-up, kan de emissie van de fluorescentie bij twee verschillende golflengte bands opgenomen worden gelijktijdig, waardoor de berekening van een ratio van rood-tot-groen fluorescentie na te denken van de membraanpotentiaal in elk beeld van een time-lapse serie.
Figuur 2: configuratie van het imaging systeem. De belangrijkste componenten van de imaging systeem gebruikt om te afbeelding de spectrale veranderingen van de spanning-gevoelige fluorescent proteïne spiegeling van de mogelijke wijzigingen van de membraan met een hoge temporele resolutie worden afgebeeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De expressie van VSFP-CR in CMs wordt bereikt door lentivirale transductie. Directe uitdrukking aan het CM-subtype van belang, heeft de lentivirus een promotor element (de MLC2v -enhancer) die specifiek transcriptie in ventriculaire-achtige iPSC-CMs10 drijftbevat. Wanneer de iPSC-CMs waarmee een mengsel van cellen atriale-achtige, knooppunten-achtige en ventriculaire-achtige zijn getransduceerde met deze lentivirus, uit VSFP-CR zich alleen in de ventriculaire-achtige cellen. Aangezien de actiepotentiaal optische beeldvorming, hangt af van deze TL sensor, vertegenwoordigen de opgenomen actie potentials uitsluitend het CM-subtype van belang (Figuur 3).
Figuur 3: promotor-gedreven VSFP uitdrukking voor de potentiële imaging subtype-specifieke membraan. (een) dit schema toont hoe cardiomyocyte subtype-specifieke optische actiepotentiaal opnamen worden bereikt. (b) iPSC-CMs besmet met een VSFP onder de controle van de ventriculaire-specifieke MLC2v-enhancer worden weergegeven. De expressie van de voltage-sensor wordt waargenomen alleen in ventriculaire-achtige CMs in het GFP-kanaal (linkerdeel). De fase contrast (middelste deelvenster) en het overlaybeeld (rechtervenster) zijn ook aanwezig. De witte stippellijnen mark celbegrenzing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van iPSC afkomstige Cardiomyocytes Imaging
Opmerking: Methoden voor iPSC cultuur en cardiale differentiatie zijn gepubliceerd vóór12,13,14 en worden niet hier in detail besproken. De zuivering van iPSC-CMs door handmatige microdissection, magnetische cel scheiding of lactaat selectie is aanbevolen, afhankelijk van het gebruikte protocol van differentiatie. Voor het volgende protocol werden microdissected explantaten uit gewonnen van gebieden, gegenereerd met behulp van een enkelgelaagde differentiatie protocol13, gegrepen op dag 15 van een cardiale differentiatie en gekweekt tot dag 30 op fibronectine beklede platen zoals beschreven vóór10.
- Neem de cel cultuur platen uit de incubator en handmatig verzamelen van de cardiale explantaten in microcentrifuge buizen met behulp van een precisiepipet 200 µL. Na sedimentatie, gecombineerd de celcultuur supernatant en voorzichtig wassen de explantaten 2 x met Hank is evenwichtig zout oplossing (HBSS).
- Distantiëren van iPSC-CMs door toevoegen van collagenase type II (430 U/mL in HBSS) en hen Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Nadat de bezinking van de resterende grote cel samengeklonterd, verzamelen de bovendrijvende vloeistof waarin de gedissocieerde één iPSC-CMs en voeg dit toe aan verse CM onderhoud opslagmedium met een hoge foetale runderserum (FBS) concentratie (DMEM-F12, 20% FBS, 2 mM L-glutamine, 1:100 MEM niet-essentiële aminozuren, 100 U/mL penicilline-streptomycine en 0.1 mM β-mercaptoethanol).
- Herhaal de dissociatie als grote cel bosjes blijven. Verzamel single iPSC-CMs van centrifugeren en resuspendeer hen in CM opslagmedium met een lage concentratie FBS (2% FBS).
- Opnieuw zaad één iPSC-CMs in een dichtheid waardoor de latere beeldvorming van afzonderlijke cellen op een 3,5 cm glas-onderste cel cultuur microdish die heeft zijn bekleed met fibronectine (2 µg/cm2). Optimaliseer de seeding dichtheid voor boeiende in high-throughput experimenten. Meestal zijn 5-10 cardiale explantaten per 3,5 cm schotel voldoende; echter afhankelijk dit sterk van de explant grootte en zuiverheid.
- De één iPSC-CMs cultuur na hun dissociatie in CM onderhoud medium met 2% FBS gedurende ten minste 48 uur om ervoor te zorgen een voldoende herstel.
Opmerking: In de volgende stappen, de iPSC-CMs zijn getransduceerde met een lentivirus codering de GEVI VSFP-CR onder de controle van een MLC2v versterker10 om een ventriculaire-specifieke GEVI expressie. Anderzijds kunnen lentivirale constructies waardoor de GEVI specifiek in knooppunten - of atriale-achtige cellen uitspreken, of een aspecifieke construct herbergen de overal uitgedrukt PGK promotor, gebruikte10. Lentivirale plasmiden zijn beschikbaar op aanvraag.
Let op: Bij het werken met lentivirale deeltjes, ervoor zorgen dat het arbeidsmilieu te bevorderen het voldoende bioveiligheidsniveau heeft, voldoen aan de veiligheidsvoorschriften voor het werken met potentieel besmettelijke agentia en de nodige voorzorgsmaatregelen nemen. - Bereid het medium van de infectie door het mengen van de lentivirus10-celkweek supernatant, die is geproduceerd in de HEK293 cellen zoals beschreven vóór15, met CMs onderhoud medium met (zie stap 1.3) in een 1:1 verhouding.
- Voeg hexadimethrine bromide (en) een eindconcentratie van 8 µg/mL tot verbeteren van de efficiëntie van de infectie.
Opmerking: Als gevolg van de infectie van de hoge efficiëntie van iPSC-CMs voorafgaande concentratie van lentivirus via ultracentrifugatie is meestal niet nodig. - De CM onderhoud worden overgedragen door de enkele iPSC-CMs gecombineerd en te vervangen door het medium van de infectie bereid tijdens stap 1.7 en 1.8. Cultuur van de besmette enkele iPSC-CMs in het medium van de infectie gedurende 12 uur bij 37 ° C. Vervolgens het medium gecombineerd en opnieuw vervangen met CM onderhoud medium.
Opmerking: Een signaal van de fluorescentie van de GEVI verschijnt 48 h na de infectie. Een beeldvorming van de potentiële opnames van membraan wordt aanbevolen, 72 uur na infectie ten vroegste om ervoor te zorgen de sterkte van een goed signaal. Enkele geïnfecteerde iPSC-CMs kunnen worden gekweekt voor minstens 3 weken en opeenvolgend beeld. Als uitgebreide photobleaching tijdens een imaging-sessie optreedt, wordt het signaal van de fluorescentie herstelt na verloop van tijd. - Voor imaging, wisselen het kweekmedium cel door de Tyrode oplossing aangevuld met Ca2 + (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl2MgCl 1 mM, 10 mM glucose, 1,8 mM CaCl2en 10 mM HEPES; pH 7,35).
2. optische membraan potentiële opnames
- Plaats de imaging cupje met de iPSC-CMs in het werkgebied van een omgekeerde epifluorescence Microscoop voorzien van een afbeelding splitter, de juiste filter sets, en een camera in (bijvoorbeeld, een sCMOS camera) staat voor snelle imaging op een hoog gevoeligheid.
Opmerking: bijvoorbeeld, gebruik een excitatie van 480/40 nm band pass filter gecombineerd met een 500 nm long pass dichroïde spiegel in de Microscoop, en een 568 nm long pass dichroïde spiegel gecombineerd met 520/28 nm en 630/75 nm band pass emissie filters in de afbeelding splitter. Voor eencellige imaging biedt een high-vergroting, hoog-numerieke-diafragma olie-immersie-doelstelling de beste signaal-/ ruisverhouding. - Als elektrische pacing vereist is, installeert u pacing elektroden in de beeldvorming zaal en sluit ze aan op een stimulans generator.
Opmerking: We gebruikten een pacing inzet die twee platina-elektroden opgenomen en gemonteerd in de 3,5 cm glas-onderste cel cultuur gerechten. De cellen gelegen tussen de elektroden zijn beeld. Typische pacing parameters zijn rechthoekige pulsen van 5 ms in duur, met een amplitude van 10 V/cm elektrode afstand. - Gebruik eventueel een verwarmde Microscoop stadium om een stabiele temperatuur van de iPSC-CMs tijdens imaging, of zelfs een Microscoop incubatie kamer set-up als op lange termijn imaging is bedoeld.
- Brengen van de cellen te concentreren en plaats een cel de GEVI uitdrukken in het midden van het veld bekijken.
Opmerking: Dit gebeurt meest gunstig door gebruik te maken van de oculairs van de microscoop met behulp van een groen fluorescente proteïne (GFP) of een rood fluorescerende eiwit (RFP) filter ingesteld op de cellen, uiting geven aan de GEVI opsporen. - De optische weglengte zodat uitgestraalde licht is doorgestuurd naar de afbeelding splitter instellen Overschakelen van de filter kubus in de Microscoop naar degene worden gecombineerd met de filters in de afbeelding splitter (Zie Tabel van materialen).
- In de software controle van de camera, de overname-instellingen zodanig instellen dat snelle beeldvorming (bijvoorbeeld, 100 beelden per seconde, met een belichtingstijd van 10 ms per frame) mogelijk is.
Let op: Meestal, hierbij het weggooien van camera pixels (bijvoorbeeld8 x 8 pixels van de camera chip zijn weggegooid voor het genereren van één pixel in de time-lapse film). - Instellen van de afbeelding splitter volgens de instructie van de fabrikant. De twee beelden die de twee verschillende emissie golflengte bands vertegenwoordigen moeten naast elkaar, elk bezetten een helft van het beeld.
Opmerking: Deze stap moet slechts 1 x aan het begin van elke imaging sessie uitgevoerd. - Controleer en pas indien nodig de focus van het beeld geproduceerd door de camera.
- De helderheid van de verlichting-lichte zodat een verzadiging van de pixels wordt vermeden; Dit kan het gemakkelijkst worden gedaan met behulp van een kleurenpalet waarin verzadigde pixels worden vertegenwoordigd door een unieke kleur.
Opmerking: Tijdens al deze voorbereidingen voor de beeldvorming, beperken de blootstelling van het monster aan de excitatie lichte tot het noodzakelijke bedrag (dat wil zeggen, niet laten het licht op voor uitgebreid perioden) om te voorkomen dat photobleaching van de GEVI. - Instellen van de verwerving van de tijdreeks (b.v., 5.000 beelden bij 100 kaders per seconde voor de duur van een serie van 50 s). Dim het licht in de kamer (met inbegrip van computer-monitoren) om te voorkomen dat strooilicht de meting beïnvloeden. Als de excitatie lichte sluiter is niet gecontroleerd door de denkbaar software, open het net voordat de overname.
- Beginnen met de overname van de foto-serie. Desgewenst elektrische pacing is, beginnen de pacing volgorde op het juiste tijdstip, tenzij het wordt automatisch geïnitieerd door de beeldbewerkingssoftware. Als de toepassing van een farmacologische agent wordt gezocht, dit ook handmatig doen (bijvoorbeelddoor pipetting 100 µL van de agent in een tienvoudige einde concentratie aan de kamer van de opname met 900 µL van buffer en voorzichtig mengen met de pipet) of met behulp van een constante-flow perfusie systeem.
- Wanneer de verwerving is voltooid, sluit u de excitatie lichte sluiter indien nodig. De opname op te slaan op de harde schijf.
- Het verlaten van de opname-instellingen ongewijzigd (d.w.z., belichtingstijd, framesnelheid en lichtintensiteit), uitvoeren van een opname van de fluorescentie van de achtergrond (zoals in stap 2.11) over een gebied van het dekglaasje aan niet met cellen of via een ander dekglaasje aan waarop niet cellen hebben is uitgezaaid.
Opmerking: Als opeenvolgende metingen worden uitgevoerd zonder de overname-instellingen te wijzigen, is slechts één achtergrond fluorescentie opname is noodzakelijk voor alle deze metingen. - Desgewenst voeren extra experimenten (stappen 2.4 – 2.13) op verschillende iPSC-CMs, gelegen op de dezelfde dekglaasje aan. Wees ervan bewust dat alle CMs op het dekglaasje aan zal worden beïnvloed, in het geval dat een drug werd toegepast.
3. analyse
> Opmerking: Afhankelijk van de imaging software gebruikt (dat is meestal een propriëtaire softwarepakket geboden door de fabrikant van de camera of de hele fluorescentie imaging systeem), het uitvoeren van de analyse van de verworven beelden deels of zelfs mogelijk volledig binnen dit softwarepakket. Echter, hier een werkstroom voor beeldanalyse die kan worden uitgevoerd met open bronsoftware (dat wil zeggen, het beeld analyse platform ImageJ)16, die gemakkelijk kan worden geïnstalleerd met behulp van een distributie zoals Fiji17, en de R-pakket voor statistische computing18 worden beschreven. Kort, regio's van belang (ROIs) vertegenwoordigen cellen of achtergrond worden getekend in ImageJ en de gemiddelde fluorescentie in deze ROIs na verloop van tijd wordt geëxporteerd naar een bestand worden, vervolgens verder geanalyseerd in R of, als alternatief, met spreadsheet-software.
- In de beeldbewerkingssoftware, opslaan of exporteren van de tijdreeks verworven afbeelding (de opname met de cellen en de bijbehorende achtergrond opname) naar een indeling (bijvoorbeeldTIF) die kan worden gelezen door ImageJ. Ook gebruiken de BioFormats-plugin (https://imagej.net/Bio-Formats), waarin de routines inschakelen ImageJ om te lezen oorspronkelijke bestandsindelingen uit verschillende merken van imaging systeem fabrikanten.
Opmerking: De volgende stappen wordt ervan uitgegaan dat de beeldvorming intervallen hetzelfde tijdens de opname. Als dit niet het geval, wellicht de timing informatie vanuit de beeldbewerkingssoftware exporteren en opnemen in de verdere analyse. - Open de TIF-stack met de cellen die in ImageJ.
- Gebruik het gereedschap freehand selecteren om te tekenen van een ROI over een fluorescerende cardiomyocyte in het rode kanaal. Zorg ervoor dat de ROI groot genoeg, is zodat de cel niet uit de ROI terwijl de aanbestedende verplaatst.
- Open de ROI manager plugin ('analyseren | Tools | ROI Manager') en druk op de knop 'Add [t]' toe te voegen van deze ROI als ROI1.
- Sleep de ROI over dezelfde cel staan in het groene kanaal en voeg deze ROI als ROI2.
- In de ' analyseren | Instellen van metingen menu, Deselecteer alle opties met uitzondering van 'Mean grijswaarde'.
Opmerking: Dit moet worden gedaan slechts 1 x in een ImageJ sessie. - In de manager van de ROI, drukt u op de ' meer | Multi maatregel ' knop. Selecteer de opties 'Meten alle segmenten' en 'Één rij per segment' en druk op 'OK'. Er wordt een venster geopend met een werkblad met drie rijen (het Segmentnummer en de gemiddelde fluorescentie in de twee ROIs de cel in het rood en het groene kanaal, respectievelijk).
- Gebruik ' bestand | Opslaan als het werkblad opslaan in een bestand met door komma's gescheiden waarden (CSV).
- Sluit het venster met de afbeeldingsstapel en het spreadsheetvenster zonder te sluiten van het venster van de manager van de ROI. Open de TIF-stack met de meting van de achtergrond.
- In de manager van de ROI, drukt u op de ' meer | Multi maatregel' knop. Selecteer de opties 'Meten alle segmenten' en 'Één rij per segment' en druk op 'OK'.
- Gebruik ' bestand | Opslaan als het werkblad met de achtergrondgegevens opslaan in een ander CSV-bestand.
Opmerking: De volgende berekeningen kunnen worden gedaan met spreadsheet-software. We gebruikten de R software18. Een eenvoudig voorbeeldscript dat wordt gelezen en de cel en achtergrond gegevens uit de bestanden "cell.csv" en "background.csv" de berekeningen, en plots het tijdsverloop van het membraan potentiële signaal wordt geleverd als aanvullende Code bestand 1. - Bereken uit de opname van de achtergrond, de gemiddelde intensiteit in het rood en in het groene kanaal. Deze achtergrond signaal van de signalen die de cel in de rode en groene kanaal voor het berekenen van de achtergrond-gecorrigeerde RFP en GFP signalen, respectievelijk aftrekken.
- Als een surrogaat voor de membraanpotentiaal, berekenen de verhouding RFP/GFP.
Opmerking: Deze verhouding is dimensieloze. Het kan als alternatief worden genormaliseerd naar de oorspronkelijke waarde (dat wil zeggen, ΔR/R0). Belangrijker, bevindt nuttige informatie zich in de temporele veranderingen in plaats van de absolute waarden van deze verhouding. Als gevolg van ongelijke photobleaching van het GFP en de RFP, kan een verschuiving van de basislijn in deze verhouding optreden. Indien nodig, kan deze een verschuiving van de basislijn worden gecorrigeerd door een basislijn curve en het af te trekken van het RFP/GFP verhouding10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In figuur 4a, is een representatieve één iPSC-CM afgebeeld met de witte stippellijnen markering van de ROI getrokken tijdens de imaging analyse in de RFP (links) en het kanaal GFP (rechts). Het signaal van het RFP kanaal toont een periodieke verhoging in fluorescerende intensiteit tijdens elke actiepotentiaal (figuur 4b, bovenste deelvenster). Zoals beschreven in de inleiding, is dit te wijten aan een toenemende FRET veroorzaakt door veranderingen in de membraanpotentiaal (Figuur 1). Concordantly, toont het GFP-signaal een periodieke afname van de fluorescerende intensiteit (figuur 4b, middelste deelvenster). De RFP/GFP-verhouding (figuur 4b, lagere paneel) is het biologische signaal gebruikt in downstream analyses, zoals APD50 en APD90 metingen. Met behulp van deze methode, de 30-dagen oude ventriculaire-achtige iPSC-CMs tempo bij 0,5 Hz toonde een gemiddelde APD50 (de duur vanaf het begin van de actiepotentiaal totdat de repolarisatie wordt aangevuld met 50%) van 439 ms (± 46 ms) en een gemiddelde APD90 (de duur totdat de repolarisatie is voltooid door 90%) van 520 ms (± 47 ms) (Figuur 4 c).
Figuur 4: beginselen van beeldanalyse en fundamentele actiepotentiaal kenmerken. (een) het gelijktijdig opgenomen RFP (rechts) en GFP (linkerkant) fluorescentie van een enkele iPSC-CM wordt weergegeven. De witte stippellijnen vertegenwoordigen de regio's van belang (ROI) gebruikt bij de analyse van beeldvorming. (b) Raw sporen van achtergrond-gecorrigeerde RFP, GFP, en RFP/GFP-signalen afkomstig van de ROI worden getoond. (c) de middelen en SEM van APD90 en APD50 voor één ventriculaire-achtige iPSC-CMs bij kamertemperatuur of met 0,5-Hz pacing worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Om aan te tonen dat de methode ook geschikt is voor het vastleggen van wijzigingen in de duur van de actie potentieel, werden de iPSC-CMs elektrisch gestimuleerd op het verhogen van de tarieven van de stimulatie variërend van 0.4 tot 2,5 Hz, optrekken van het steunpercentage elke vijf beats (Figuur 5). Een typische optisch opgenomen membraan potentiële signaal van één iPSC-CM is afgebeeld in figuur 5a. De eerste vier actie potentieel tempo van elke gewonnen werden gemiddeld, demonstreren van een geleidelijke verkorting van de actie potentieel tegen verhoogde kloppend tarieven (Figuur 5b). Gemiddeld latere tempo beats is een effectieve methode van vermindering van het lawaai die inherent zijn aan optisch opgenomen actie potentials10. Er zij op gewezen dat de afgebeelde experiment niet het volledige bedrag van de tarief-afhankelijke actiepotentiaal verkorting mogelijk, gezien het feit dat wij tempo de cel voor slechts vijf beats op elke pacing tarief, dat wellicht niet voldoende om te bereiken evenwicht kan vangen.
Figuur 5: Effect van de pacing frequentie op de duur van de actiepotentiaal. (een) Een iPSC-CM was tempo op het verhogen van de frequenties variërend van 0.4 tot 2,5 Hz zoals aangegeven (de één elektrische pacing pulsen worden vertegenwoordigd door pijlen). (b) voor elke pacing frequentie, een gemiddelde AP was berekend op basis van de eerste vier APs op deze frequentie. De gemiddelde APs uitgezet als een overlay, demonstreren de AP verkorten met toenemende pacing tarieven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De methode kan ook worden gebruikt om te onderzoeken elektrofysiologische gevolgen van drugs toegepast op de iPSC-CMs (Figuur 6). Hier, werd isoproterenol, een niet-selectieve β-adrenoreceptor-agonist, toegepast op spontaan-kloppend iPSC-CMs zoals aangegeven, wat leidt tot een snelle stijging de afstraffing (Figuur 6a). Een dosis-responscurve toont het effect van verschillende concentraties van de Isoproterenol op de frequentie van de afstraffing van iPSC-CMs is afgebeeld in Figuur 6b.
Figuur 6: Effect van isoproterenol op de frequentie van de afstraffing. (een) het representatieve rauwe optische actiepotentiaal traceren van een spontaan-pak slaag één iPSC-CM wordt weergegeven. Isoproterenol (met een eindconcentratie van 1 µM) werd toegevoegd aan iPSC-CMs, zoals aangegeven door de balk. (b) deze dosis-responscurve toont het effect van verschillende isoproterenol concentraties op de frequentie van de afstraffing van iPSC-CMs. de foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode kunt een optische recording van APs van een specifiek subtype (d.w.z., ventriculaire-achtige cellen) van CMs gegenereerd op basis van menselijke iPSCs. Menselijke iPSC-CMs een opkomende instrument om een grote verscheidenheid aan biologische en medische problemen, en de differentiatie naar verschillende subtypen van CM is een belangrijke bron van experimentele variabiliteit. Met behulp van specifieke promotor elementen, wordt de expressie van een GEVI specifiek bereikt in CMs die het subtype van belang, die zijn dan optisch beeld.
De succesvolle verwerving van APs uit één iPSC-CMs is afhankelijk van de dichtheid van het reseeding na de dissociatie. Als de cellen worden reseeded te dichte, is het tijdrovend te vinden van geïsoleerde één iPSC-CMs die geen deel uitmaken van een elektrische syncytium. Echter beïnvloeden ook laag seeding dichtheden negatief het voortbestaan van de cellen. Dus is een planmatige testen van verschillende seeding dichtheden aangeraden, vooral voor het verrichten van experimenten die afhankelijk van hoge-doorvoer imaging zijn.
De VSFP ondergaat tijdens de Beeldacquisitie, photobleaching, die de signaal-ruisverhouding, vooral tijdens langere experimenten ongunstig kan beïnvloeden. Als snelle photobleaching aanwezig tijdens het experiment is, zorg ervoor dat de excitatie lichte sluiter is alleen geopend tijdens de Beeldacquisitie of noodzakelijke voorbereiding stappen (zoekt en zich te concentreren op VSFP-uiten cellen), die moeten worden zo spoedig mogelijk uitgevoerd. Bovendien verminderen de kracht van het licht naar het minimale bedrag dat nodig excitatie en maak gebruik van het dynamisch bereik van de camera van de hoog-gevoeligheid voor Beeldacquisitie gebruikt.
Bij het opstellen van de ROI tijdens de beeldanalyse, te beseffen dat de iPSC-CMs tijdens contractie verplaatsen en binnen de ROI in alle afbeeldingen van de afbeeldingsstapel blijven moeten. Vanwege de aard van de ratiometric van de VSFP, elke beweging van de cel uit de ROI leidt niet tot kunstmatige signalen maar ongunstig kan beïnvloeden de signaalkwaliteit. Echter ROIs die te groot zijn en bevatten onnodig-grote niet-signaal-producerende gebieden ook negatief van invloed zijn op de signal-to-noise verhouding en moeten worden vermeden.
Gedifferentieerde iPSC-CMs dat hebben toestemming gekregen om te rijpen voor ten minste 30 dagen nadat een cardiale inductie zijn gebruikt voor de Resultaten van de vertegenwoordiger. Na deze periode van rijping, verschillende CM subtypes, zoals knooppunten-, atriale-, of ventriculaire-achtige cellen kunnen worden onderscheiden. Deze cellen zijn nog onvolwassen en bereiken slechts een embryonale-achtige fenotype in tweedimensionale (2D) cultuur systemen op het gebied van elektrische eigenschappen evenals calcium behandeling van19. Deze algemene beperkingen voor iPSC-CMs moeten worden beschouwd, zoals ze experimentele resultaten onafhankelijk is van de methode die wordt gebruikt voor het meten van de actie potentieel kunnen verwarren. Meer geavanceerde driedimensionale (3-D) cultuur systemen hebben aangetoond veelbelovende resultaten naar verdere rijping20, en de hier beschreven methode zou waardevol zijn in dit verband.
De huidige gouden standaard voor meten APs voor iPSC-CMs is patch klem opnamen, waardoor een zeer gedetailleerde analyse van de verschillende kenmerken van de AP en zelfs kunt meten één ion kanaal stromen. Daarnaast kan de absolute waarden (bijvoorbeeld, de rust membraanpotentiaal) worden gemeten. Optische AP opnames zijn daarentegen gebaseerd op relatieve veranderingen van de membraanpotentiaal. Vanwege de relatief trage intrinsieke kinetiek van de VSFP, bepaalde AP-kenmerken, zoals de "overschrijding", uit de lezing kunnen worden afgerond, en een zinvolle kwantificatie van snelle functies, zoals de AP ophaal snelheid, is niet mogelijk. Echter, in een typische experimentele opstelling, niet de absolute waarden, maar verschillen in waarden (bijvoorbeeldtussen verschillende cellijnen of voor en na de toepassing van een drug) worden gemeten. Dit op betrouwbare wijze kan worden bereikt met de optische methode beschreven in dit manuscript voor kenmerken zoals AP duur (bv APD90 of APD50) of kloppend rente met een veel hogere doorvoer in vergelijking met de patch klem10 . Bovendien, de niet-invasieve aard van deze technologie kunt u meerdere metingen van dezelfde cel via tijd10. Optische AP opnamen en patch-clamp moeten dus worden beschouwd als aanvullende hulpmiddelen en gebruikt, afhankelijk van de experimentele vraag die moet worden beantwoord.
Optische AP opnames kunnen worden bereikt door de uitdrukking van een GEVI of door de toepassing van een potentiometrische fluorescente kleurstof (bv, di-8-ANEPPs)-21. De fluorescente kleurstoffen hebben meestal gunstiger fluorescentie kinetiek, maar kunnen niet worden omgeleid naar een bepaalde subtype van cardiomyocytes als ze zijn niet genetisch-gecodeerd. Een aantal GEVIs gebaseerd op verschillende werkingsprincipes geweest ontwikkelde22. Hier, wordt de FRET gebaseerde GEVI VSFP-CR11 gebruikt. De belangrijkste reden voor deze keuze was de ratiometric aard van deze indicator, die op cellulaire depolarisatie met een toename in het rood en een afname van de groene fluorescentie reageert als de groen fluorescente proteïne is opgewekt. Dit is gunstig op het gebied van cardiologie, omdat deze een ratiometric indicator minder gevoelig voor artefacten is, veroorzaakt door cel mutaties door contracties van de cardiomyocytes dan indicatoren die reageren op de depolarisatie alleen door een verandering van hun intensiteit van de fluorescentie.
Terwijl alleen resultaten uit experimenten gericht op ventriculaire-achtige iPSC-CMs met behulp van de MLC2v -enhancer worden hier gepresenteerd, is het ook mogelijk om te richten atriale - of knooppunten-achtige CMs met behulp van verschillende subtype-specifieke promotor elementen10. De methode in detail te beschrijven, dit manuscript gericht op imaging één iPSC-CMs dat hebben al uitgezaaid op een dekglaasje aan glas, als dit de analyse van AP eigenschappen van afzonderlijke cellen maakt en de hoogste signal-to-noise verhouding biedt. Deze technologie maakt echter ook de beeldvorming van CMs die zijn geïntegreerd met andere cellen in een elektrische syncytium of een 3D-structuur. Dit is van bijzonder belang, zoals 3D-cel cultuur modellen steeds vaker gebruikt worden en is aangetoond dat het bieden van eigenschappen anders dan 2D-modellen20. Afhankelijk van de beeldvorming set-up en de definitie van de ROI, kunnen optische signalen van grotere gebieden van het 3D-weefsel of van afzonderlijke cellen in het weefsel worden geanalyseerd. Bovendien meerdere cellen kunnen worden gelijktijdig beeld en geanalyseerd afzonderlijk, wat leidt tot een aanzienlijk hogere doorvoer.
Tezamen, kan de methode die hier gepresenteerd de toepasselijkheid van iPSC-CMs op het gebied van aritmie onderzoek verbeteren doordat de snelle optische fenotypering voor iPSC-CMs voor aritmie-gerelateerde fenotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies uit de Duitse Research Foundation (Si 1747/1-1), het anders Kröner-Fresenius-Stiftung en de Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
- Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research. Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).
- Rocchetti, M., et al. Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).
- Sinnecker, D., et al. Modeling long-QT syndromes with iPS cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).
- Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art. Life Sciences. , 98-113 (2016).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Den Hartogh, S. C., Passier, R. Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity. Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).
- Schweizer, P. A., et al. Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229 (2017).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Chen, Z., et al. Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes. European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2008).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).
- Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scientific Reports. 7, 5464 (2017).
- Dorn, T., et al. Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity. Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).
- Kaestner, L., et al. Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).
