Summary
Burada özellikle ventriküler benzeri indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı cardiomyocytes içinde optik görüntü Aksiyon potansiyelleri, bir yöntem mevcut. Bu yöntem bir voltaj duyarlı floresan protein organizatörü tahrik ifade üzerinde dayanır.
Abstract
İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (IPSC-CMs) oluşturulan Cardiomyocytes kardiyovasküler araştırmalarında ortaya çıkan bir araçlardır. Hücreleri homojen bir nüfusa olmak yerine, geçerli farklılaşma iletişim kuralları tarafından oluşturulan IPSC CMs ventrikül hücrelerle karışımı temsil eder-, atriyal-ve fenotipik analizlerini zorlaştırmaktadır nodal benzeri fenotipleri. Burada, ventrikül benzeri IPSC-CMs özellikle optik kayıt Aksiyon potansiyelleri için bir yöntem sunulur. Bu bir genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi ventrikül özgü organizatörü öğe kontrolü altında olduğu bir yapı ile lentiviral iletim tarafından sağlanır. Ne zaman IPSC-CMs sahip bu yapı transduced, Gerilim Algılayıcısı hızlandırılmış floresans mikroskobu kullanarak alt türü özel optik membran potansiyeli kayıtları etkinleştirme sadece ventrikül benzeri hücrelerde, ifade edilir.
Introduction
İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSCs) elde edilen Cardiomyocytes (CMs) olumsuz kalp ilaç etkileri1,2 kalp hastalığı yeni tedaviler, araştırmak için ve ekran için moleküler mekanizmaları incelemek için gelişmekte olan bir araçlardır ,3. En başından beri channelopathies gibi Aritmojenik hastalıklar bu araştırma alanı4önemli bir odak noktası olmuştur. Sonuç olarak, CMs, elektrik fenotipleri aritmiler veya Aksiyon potansiyeli (AP) türleri morfoloji, değişimler gibi araştırmak için bu teknolojiyi kalbinde yöntemlerdir.
Bir önemli dikkate IPSC-CMs uygulamada geçerli kardiyak farklılaşma protokolleri hücreleri homojen bir nüfusa neden olur. Bunun yerine, onlar, daha doğrusu sinüs düğümü, atriyal, andıran hücreler ve olgunlaşma5,6,7,8farklı düzeylerde ventrikül CMs bir karışımıdır. Bu heterojenlik ilgili bir kaynak olabilir deneysel değişkenliği, özellikle AP süresi (APD) gibi parametreleri incelenmiştir, hangi özünde farklı CM alt türleri arasında (Örneğin, APD içinde daha kısa ventrikül CMS atriyal). Bu sorunu çözmek için geleneksel yaklaşım tek IPSC-CMs yama kelepçe yöntemi kullanarak araştırmak için ise her hücre nodal olarak sınıflandırmak için-, atriyal-, veya ventriküler benzeri, onun AP morfoloji9dayalı. Daha sonraki herhangi bir analiz sonra CM alt faiz türünü temsil eden hücrelere kısıtlanabilir. Bu stratejinin önemli dezavantajı onun sınırlı performans ve ölçeklenebilirlik eksikliği var. Ayrıca, yama kelepçe Elektrofizyoloji invaziv doğası aynı hücreleri görüntüleme uzun süreler boyunca sırayla izin vermez.
Burada, biz optik APs IPSC-CMs belirli alt görüntü için geliştirilmiş bir yöntem10 deneysel ayrıntılar sağlar. Bu alt tür heterojenite sorununun üstesinden gelir ve daha fazla işlem hacmi IPSC-CMs genetik varyantların taşıyan veya maruz farmakolojik ajanlar olmak hızlı fenotipleme izin geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde artırır.
Alt tür özel optik görüntüleme yaklaşım genel bakış
Depolarizasyon ve hücre zarının repolarization floresans özelliklerini değiştirmek, bir genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi (GEVI), optik görüntü değişiklikleri membran potansiyeli CMS için kullanılır. Burada uygulanan GEVI gerilim algılamalı floresan VSFP-CR11çifti bir yeşil (Yonca) ve kırmızı (mRuby2) Floresan protein (Şekil 1A) erimiş bir gerilim algılamalı transmembran etki alanı oluşur, proteindir. İki fluorophores yakın yakınlığı nedeniyle, bir kısmını kırmızı floresan protein üzerinden için Förster rezonans enerji transferi (FRET) aktarılan uyarma enerji yeşil flüoresan protein uyarma sonuçlanır. Bu nedenle, salma yeşil ve kırmızı floresan proteinler (Şekil 1A, üst panel) uyarma yeşil flüoresan protein sonuçlanır. Hücre depolarizes, Gerilim Algılayıcısı bir yapısal yeniden FRET verimliliği arttırma iki floresan protein bir hale gelmesini çeviren oluşur. Böylece, daha uyarma enerji yeşil kırmızı floresan protein için (Şekil 1A, alt panel) aktarılır. Sonuç olarak, depolarized hücrede yeşil floresans emisyon dimmer ise kırmızı floresans emisyon hücre membran potansiyeli (Şekil 1B) dinlenme, daha parlak.
Şekil 1: membran VSFP-iade ile potansiyel optik görüntüleme VSFP-CR gösterilir voltaj duyarlı floresan protein eylem tasvir eden (A) A şematik. Hücre zarının depolarizasyon gerilim algılamalı transmembran etki alanındaki yapısal yeniden yeşil (GFP) ve kırmızı (RFP) Floresan protein, intramolecular Förster verimliliğini artırma hale gelmesini çevirir. rezonans enerji transferi (FRET). (B) emisyon spectra, GFP istirahat membran potansiyeli (üst paneli) hücreleri ve depolarized hücreleri (alt paneli) uyarma üzerine bir VSFP tasvir edilmektedir. Spektral değişiklik depolarizasyon üzerine netlik için abartılı olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Kırmızı ve yeşil floresans emisyon ayıran ve onları iki bitişik alanları projeleri bir resim splitter ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanarak potansiyel membran dalgalanmaları yansıtma FRET verimliliği değişimler görüntüsü bir sCMOS kamera (Şekil 2) çip. Bu kurulum ile iki farklı dalga boyu bantları, floresans emisyon aynı anda, her zaman hata bir dizi suretinde potansiyel membran yansıtacak şekilde kırmızı yeşil floresans oranında hesaplanması sağlayan kaydedilebilir.
Şekil 2: görüntüleme sisteminin yapılandırmasını. Görüntüleme sistemi, asıl bileşenleri yüksek zamansal çözünürlükte membran olası değişiklikleri yansıtması voltaj duyarlı floresan protein spektral değişiklikleri tasvir edilir görüntü için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
VSFP-CR CMS ifade lentiviral iletim tarafından sağlanır. CM alt türü ifade ilgi yönlendirmek için özellikle transkripsiyon ventrikül benzeri IPSC-CMs10sürücüler bir organizatörü öğesi ( MLC2v artırıcı) lentivirus içeriyor. Ne zaman bir karışımı atriyal benzeri, nodal benzeri ve ventrikül benzeri hücre temsil IPSC-CMs ile bu lentivirus transduced, VSFP-CR sadece ventrikül benzeri hücrelerde ifade edilir. Optik Aksiyon potansiyeli görüntüleme bu floresan sensörüne bağlı olduğundan, kaydedilen Aksiyon potansiyelleri sadece CM alt faiz (Şekil 3) türünü temsil eder.
Şekil 3: organizatörü tahrik VSFP ifade alt türü özel membran potansiyeli görüntüleme için. (bir) cardiomyocyte alt türü özel optik Aksiyon potansiyeli kayıtları nasıl elde bu şematik gösterir. (b) IPSC-CMs ventrikül özgü MLC2v artırıcı kontrol altında bir VSFP ile enfekte gösterilir. Gerilim Algılayıcısı ifade sadece ventrikül benzeri CMs GFP kanal (sol panelde) olarak görülmektedir. Faz kontrast (orta Masası) ve Bindirme görüntüsünü (doğru kapı aynası) de temin edilmektedir. Beyaz noktalı çizgiler hücre sınırları işaretleyin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlanması IPSC kaynaklı Cardiomyocytes görüntüleme
Not: Yöntem IPSC kültür ve kardiyak farklılaşması için12,13,14 önce yayınlandı ve burada ayrıntılı olarak ele değil. Arıtma IPSC-CMS manuel mikrodiseksiyon, manyetik hücre ayırma veya laktat seçim tarafından kullanılan farklılaşma iletişim kuralı bağlı olarak tavsiye edilir. Aşağıdaki iletişim kuralı için oluşturulan alanları, dayak üzerinden microdissected explants monolayer farklılaşma Protokolü13kullanarak, kardiyak ayırt etme günü 15 ve fibronektin kaplı plakalar üzerinde 30 güne kadar açıklandığı gibi kültürlü 10' dan önce.
- Hücre kültür plakaları kuluçka makinesi dışarı almak ve el ile kardiyak explants 200 µL pipet kullanarak microcentrifuge tüpler içine toplamak. Sedimantasyon sonra hücre kültürü süpernatant Aspire edin ve yavaşça'nın 2 x Hank ile dengeli explants tuz yıkama çözüm (HBSS).
- Collagenase tip II ekleyerek IPSC-CMs ayırmak (430 U/mL HBSS) ve onları 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
- Sonra kalan büyük hücreli sedimantasyon kümeler, Disosiye tek IPSC CMs içeren süpernatant toplamak ve bu yüksek fetal Sığır serum (FBS) konsantrasyonu (DMEM-F12, %20 FBS, 2 mM içeren taze CM bakım ortamına Ekle L-Glutamine, 1: 100 MEM esansiyel olmayan amino asitler, 100 U/mL penisilin-streptomisin ve 0,1 mM β-mercaptoethanol).
- Büyük hücreli kümeleri kalır ayrılma işlemini yineleyin. Santrifüjü tarafından tek IPSC-CMs ve onları CM orta düşük FBS konsantrasyon içeren resuspend toplamak (%2 FBS).
- Tek IPSC-CMs fibronektin (2 µg/cm2) ile kaplı bir 3,5 cm cam alt hücre kültür microdish üzerinde tek hücre sonraki görüntüleme sağlayan bir yoğunluk içinde yeniden tohum. Tohumlama yoğunluğu yüksek üretilen iş deneylerde kavramasindan önce en iyi duruma getirme. Genellikle, 5 – 10 kardiyak explants ücret 3.5 cm çanak yeterli; Ancak, bu ağır explant boyut ve saflık bağlıdır.
- Sonra onların ayrılma CM bakım Orta % 2 içeren tek IPSC CMs kültür FBS en az 48 saat için yeterli bir malın güvenliğini garantiye almak için.
Not: sonraki adımda IPSC CMs kodlama GEVI VSFP-ventriküler özgü GEVI ifade ulaşmak için CR MLC2v artırıcı10 kontrol altında bir lentivirus ile transduced. Alternatif olarak, lentiviral yapıları GEVI nodal veya atriyal-benzeri hücrelerde özellikle ifade etmek için izin veya belirsiz bir yapı ubiquitously ifade PGK organizatörü yataklık kullanılan10olabilir. Lentiviral plazmid talep üzerine temin edilmektedir.
Dikkat: lentiviral parçacıkları ile çalışırken, çalışma ortamı potansiyel enfeksiyöz ajanlar ile çalışmak için güvenlik talimatları için uygun ve gerekli güvenlik önlemleri yeterli Biyogüvenlik düzeyi olduğundan emin olun. - Enfeksiyon orta lentivirus10karıştırılarak hazırlamak-HEK293 hücrelerde15, CMs bakım orta ile daha önce açıklandığı gibi üretilen hücre kültürü süpernatant, içeren (bkz. Adım 1.3) 1:1 oranında.
- Hexadimethrine bromür 8 µg/mL enfeksiyon verimliliği artırmak için son bir konsantrasyon ekleyin.
Not: yüksek enfeksiyon nedeniyle verimliliği IPSC-CMs önceki konsantrasyon lentivirus ultrasantrifüj aracılığıyla, genellikle gerekli değildir. - Tek IPSC CMs CM bakım ortamından Aspire edin ve 1.7 ve 1.8 adımları sırasında hazırlanan enfeksiyon orta yerine. Enfeksiyon orta 12 h 37 ° C'de için virüslü tek IPSC-CMs kültür Sonra orta Aspire edin ve tekrar CM bakım orta ile değiştirin.
Not: GEVI bir floresan sinyal 48 h enfeksiyon sonra görünür. Membran potansiyeli kayıtları görüntüleme, enfeksiyon erken, sonra 72 h uygun sinyal gücü sağlamak için önerilir. Tek virüslü IPSC-CMs en az 3 hafta boyunca kültürlü ve sırayla görüntüsü. Geniş photobleaching bir görüntüleme oturumu sırasında oluşursa, floresans sinyal zaman içinde kurtarır. - Görüntüleme önce hücre kültür orta Ca2 + ile desteklenmiş Tyrode'nın çözüm tarafından Döviz (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM glikoz, 1.8 mM CaCl2ve 10 mM HEPES; pH 7,35).
2. optik membran potansiyeli kayıtları
- Sahne Alanı'ndaki bir resim splitter, uygun filtre setleri ve bir kamera (Örneğin, bir sCMOS kamera) yüksek, yüksek hızlı görüntüleme yeteneğine sahip bir ters epifluorescence mikroskop IPSC CMs içeren görüntüleme odası yer duyarlılık.
Not: Örneğin, 480/40 nm bant geçiren uyarma filtre kullanımı 500 nm uzun taramalı Dikroik ayna içinde mikroskop ile birlikte ve 568 nm uzun taramalı Dikroik ayna 520/28 ile kombine nm ve 630/75 nm bant geçiren emisyon filtrelerini resim splitter. Tek hücreli görüntüleme için en iyi sinyal / gürültü oranı yüksek büyütme, yüksek-sayısal-diyafram yağı daldırma amacı sağlar. - Elektrik pacing gerekiyorsa, pacing elektrotlar görüntüleme odasında yükleyin ve bunları bir uyarıcı jeneratöre bağlayın.
Not: 3,5 cm cam alt hücre kültür yemekleri iki platin elektrotlar bulunan ve donatılmış bir hız ayarlama iç metin kullanılır. Elektrotlar arasında yer alan hücreleri görüntüsü. Tipik hız ayarlama 5 ms dikdörtgen darbeleri süresi, 10 V/cm elektrot mesafe bir genliği ile parametreleridir. - İsteğe bağlı olarak, bir ısıtmalı mikroskop sahne uzun vadeli görüntüleme isteniyorsa IPSC CMS istikrarlı bir sıcaklık görüntüleme veya hatta bir mikroskop kuluçka odası kurulumu sırasında emin olmak için kullanın.
- Hücreleri için odaklanmak ve GEVI görüntüleme alanının ortasına ifade bir hücreye yerleştirin.
Not: Bu en uygun göz mercekleri yeşil flüoresan protein (GFP) veya kırmızı bir floresan protein (RFP) filtre GEVI ifade hücreleri tanımlamak için küme kullanma mikroskop kullanarak yapılır. - Optik yolunu ayarlama böylece ışık yayılan resim ayırıcı yönlendirilir. Resim splitter filtrelerde ile kombine olarak bir geçiş yapmak filtre küp mikroskobu ( Tablo malzemelerigörmek).
- Kamera kontrol yazılımı, yüksek hızlı görüntüleme (Örneğin, 100 kare / saniye çekim hızı kare başına 10 MS ile) mümkündür satın alma ayarlarını ayarlayın.
Not: Genellikle, bu kamera piksellerinin binning içerir (Örneğin, 8 x 8 piksel kamera Chip binned bir piksel hızlandırılmış film oluşturmak için). - Resim splitter üreticinin yönerge göre ayarlayın. İki farklı emisyon dalga boyu bantları temsil eden iki resim her bir işgal birbirine bitişik olmalıdır görüntü yarısı.
Not: Bu adım olmak zorunda sadece 1 x görüntüleme her oturumun başlangıcında yapılır. - Kontrol edin ve gerekirse, fotoğraf makinesi tarafından üretilen görüntü odağı ayarlayın.
- Böylece herhangi bir doygunluk piksellerin kaçınılması aydınlatma ışık parlaklığını ayarlayın; Bu en kolay doymuş piksel tarafından benzersiz bir renk temsil edildiği bir renk paletini kullanarak yapılabilir.
Not: hazırlıklar sırasında görüntüleme önce örnek maruz kalma (yani, ışığı için genişletilmiş bir süre terk) gerekli miktar ışık uyarma sınırı GEVI photobleaching önlemek için. - Saat serisi edinim kadar ayarını (Örneğin, bir dizi süresince 50 saniyede 100 kare 5000 fotoğraf s). Kaçak ışık ölçüm etkileyen önlemek için (bilgisayar monitörleri de dahil olmak üzere) odada ışık loş. Uyarma ışık çekim görüntüleme yazılımı tarafından denetlenmez, o sadece satın alma başlamadan önce açın.
- Görüntü serisi edinimi başlatın. Elektrik pacing isterseniz, otomatik olarak görüntüleme yazılımı tarafından başlatılan sürece uygun zamanda noktada pacing sıra başlatılır. Farmakolojik Ajan uygulanması isteseydim, bunu da el ile yapmak (Örneğin, 900 µL arabelleği içeren ve yavaşça pipet ile karıştırma kayıt odası'na on kat sonunda konsantrasyon aracının pipetting 100 µL tarafından) veya kullanarak bir Sabit akış perfüzyon sistemi.
- Satın alma tamamlandığında, gerekirse uyarma ışık panjurları kapa. Kayıt sabit diske kaydedin.
- Kayıt ayarları (yani, çekim hızı, kare hızı ve ışık şiddeti) değiştirmeden bırakarak, arka plan Floresan (aynı derecede içinde adım 2.11) kaydı hücreleri içeren değil coverslip bir bölge veya başka bir coverslip hangi Hayır işlemi hücreler seçilir.
Not: ardıl ölçümler satın alma ayarları değiştirmeden gerçekleştirilmesi durumunda, yalnızca bir arka plan floresans kayıt bu ölçümler için gereklidir. - İsterseniz, ek deneyler (adım 2.4-2.13) farklı IPSC-CMs aynı coverslip üzerinde yer alan gerçekleştirin. Bir uyuşturucu uygulandı diye coverslip tüm CMs etkilenecek unutmayın.
3. analiz
> Not: (Bu genellikle kamera veya görüntüleme sistemi bütün floresans üreticisi tarafından sağlanan bir özel mülk yazılım paketi), kullanılan görüntüleme yazılımı üzerinde bağlı olarak kısmen alınan görüntülerin çözümlemeler, hatta mümkün olabilir tamamen bu yazılım paketinin içinde. Ancak, burada bir iş akışını ile gerçekleştirilen görüntü analizi ve açık kaynak yazılım (yani, görüntü analiz platformu ImageJ) elverişli bir konuma sahip gibi Fiji17ve R paket için bir dağıtım kullanılarak yüklenebilir16, istatistiksel bilgi işlem18 açıklanır. Kısaca, hücreleri veya arka plan gösteren faiz (ROIs) bölgelerinde ImageJ içinde çekilir ve zaman içinde bu ROIs içinde floresans demek o zaman, daha fazla R veya alternatif olarak, elektronik tablo yazılımı ile analiz edilecek bir dosyaya dışa aktarılır.
- Görüntüleme yazılımındaki veya elde görüntüsü saat serisi (hücreleri içeren kayıt ve karşılık gelen arka plan kayıt) (Örneğin, TIF) ImageJ tarafından okunabilir bir biçime verme kaydedebilirsiniz. Alternatif olarak, ImageJ görüntüleme sistemi üreticileri farklı markalardan özel dosya formatlarını okuyabilir sağlayan yordamlar sağlar BioFormats eklentisi (https://imagej.net/Bio-Formats), kullanın.
Not: Aşağıdaki adımları görüntüleme aralıkları boyunca kayıt aynı olduğunu varsayar. Yoksa, zamanlama bilgilerini görüntüleme yazılımı vermek ve daha fazla çözümleme eklemek gerekli olabilir. - ImageJ hücreleri içeren TIF yığın açın.
- Floresan cardiomyocyte kırmızı kanal üzerinde bir yatırım getirisi çizmek için serbest seçim aracını kullanın. Hücrenin dışında yatırım getirisi taahhüt ederken hareket etmez böylece ROI kadar büyük olduğundan emin olun.
- ROI Yöneticisi eklenti açın ('analiz | Araçlar | ROI Yöneticisi ') ve bu yatırım getirisi ROI1 eklemek için 'Ekle [t]' düğmesine basın.
- ROI yeşil kanal aynı hücreye sürükleyin ve bu yatırım getirisi ROI2 ekleyin.
- İçinde ' analiz | Ayarla ölçümlerin menüsü, 'gri değeri Mean'hariç tüm seçenekleri seçimini kaldırır.
Not: Bu sadece 1 x ImageJ oturumlarınızda yapılması gerekiyor. - ROI Yöneticisi'nde, basın ' daha | Multi ölçü ' düğmesi. 'Bütün dilimleri ölçmek' ve 'Dilim başına bir satır' seçeneklerini seçin ve "OK"tuşuna basın. Üç sıra (dilim numarasını ve kırmızı ve yeşil kanal hücre sırasıyla temsil eden iki ROIs ortalama floresans) içeren bir elektronik tablo içeren bir penceresi açılır.
- Kullanım ' dosya | Farklı Kaydet elektronik bir virgülle ayrılmış değer (CSV) dosyasına kaydetmek için.
- Görüntü yığını ile pencere ve elektronik tablo penceresini ROI Yöneticisi penceresini kapatmanıza gerek kalmadan kapatın. Arka plan ölçüm içeren TIF yığın açın.
- ROI Yöneticisi'nde, basın ' daha | Multi ölçü' düğmesi. 'Bütün dilimleri ölçmek' ve 'Dilim başına bir satır' seçeneklerini seçin ve "OK"tuşuna basın.
- Kullanım ' dosya | Farklı Kaydet elektronik tablonun arka plan verileri ile başka bir CSV dosyasına kaydetmek için.
Not: Aşağıdaki hesaplamaları elektronik tablo yazılımı ile yapılabilir. Biz R yazılım18kullanılır. Dosya "cell.csv" ve "background.csv" hücre ve arka plan verilerinden hesaplamaları yapar ve membran potansiyeli sinyal zaman tabii araziler okur bir basit örnek komut dosyası ek kod dosyası 1sağlanmaktadır. - Arka plan kaydından ortalama yoğunluğu kırmızı ve yeşil kanal içinde hesaplamak. Bu arka plan sinyal arka plan-düzeltilmiş RFP hesaplamak için kırmızı ve yeşil kanal hücreyi temsil eden sinyalleri ve GFP sinyalleri, sırasıyla çıkarma.
- Potansiyel membran için bir vekil olarak, RFP/GFP oranını hesaplamak.
Not: Bu boyutsuz oranıdır. Alternatif olarak, ilk değeri (yani, ΔR/R0) için normalleştirilmiş. Önemlisi, yararlı bilgiler geçici değişiklikler yerine bu oran mutlak değerler yer alıyor. Nedeniyle düzensiz photobleaching GFP ve RFP satır taban çizgisi kayması bu oran içinde ortaya çıkabilir. Gerekirse, böyle bir satır taban çizgisi kayması temel eğri oluşturmak ve RFP/GFP oranı10' dan çıkarılarak tarafından düzeltilebilir konumdadir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 4a, bir temsilcisi tek IPSC CM RFP (sol taraf) ve GFP (sağ tarafta) kanal görüntüleme analizi sırasında çizilmiş yatırım getirisi işaretleme beyaz noktalı çizgilerle resmedilmiş. RFP kanal sinyalini her aksiyon potansiyeli sırasında (Şekil 4b, üst panel) Floresan yoğunluğu düzenli bir artış gösterir. Giriş bölümünde açıklandığı gibi bu zarda potansiyel (Şekil 1) değişiklikleri nedeniyle artan bir FRET kaynaklanmaktadır. Önemlisi, GFP sinyal floresan yoğunluğu (Şekil 4b, orta panel) periyodik bir düşüş gösterir. RFP/GFP (Şekil 4b, alt panel) APD50 ve APD90 ölçümleri gibi aşağı akım analizlerde kullanılan biyolojik sinyal oranıdır. Bu yöntem, 30 günlük eski ventrikül benzeri IPSC-CMs 439 ms (± 46 ms) ve bir ortalama APD90 (süresi 0,5 a pinti APD50 (aksiyon repolarization % 50 oranında tamamlanıncaya kadar potansiyeli başlangıcından itibaren süre) gösterdi Hz'de tempolu kullanarak repolarization % 90 tamamlanıncaya kadar) 520 MS (± 47 ms) (Şekil 4 c).
Şekil 4: ilkeleri temel Aksiyon potansiyeli özellikleri ve görüntü analizi. (bir) aynı anda kaydedilen RFP (sağ tarafta) ve tek bir IPSC cm GFP (sol taraf) Floresan gösterilir. Beyaz noktalı çizgiler görüntüleme çözümlemesi için kullanılan vade farkı (ROI) bölgeleri temsil eder. (b) arka plan-düzeltilmiş RFP, GFP, Raw izler ve yatırım getirisi elde RFP/GFP sinyalleri gösterilir. (c) anlamına gelir ve APD SEM90 ve APD50 tek ventrikül benzeri IPSC-CMS oda sıcaklığında ve 0,5-Hz pacing ile gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Yöntem aynı zamanda Aksiyon potansiyeli süresini değişiklikleri yakalama kapasitesine sahip olduğunu göstermek için IPSC-CMs elektrikle 0,4 2.5 Hz oranı artırmak için her beş vuruş (Şekil 5) arasında değişen stimülasyon oranlarda artırmaya teşvik. Tipik optik kaydedilen membran potansiyeli sinyal bir IPSC cm.den Şekil 5a' gösterilir. İlk dört Aksiyon potansiyelleri her dayak oranda artan dayak hesaplı (5b rakam) aksiyon potansiyelleri ilerici bir kısalma gösteren ortalama. Sonraki tempolu vuruş ortalaması Aksiyon potansiyelleri optik kaydedilen10' a doğal gürültü azaltma etkili bir yöntemdir. Görülen deney hızı bağımlı Aksiyon potansiyeli hücre denge ulaşmak için yeterli olmayabilir pacing her neyse, sadece beş vuruş için tempolu verilen bu mümkün, kısalma tutarının tamamı yakalanmayabilir belirtilmelidir.
Şekil 5: Aksiyon potansiyeli süresini hız ayarlama frekans etkisi. (bir) Bir IPSC CM 0,4 2.5 Hz olarak belirtildiği şekilde değişen frekansları artan tempolu (tek elektrik pacing bakliyat oklarla gösterilir). (b) hız ayarlama her frekans için Ortalama bir AP bu frekansta ilk dört APs üzerinden hesaplanmıştır. Ortalama APs pacing oranları giderek artan bir kısalma AP gösteren bir bindirme olarak çizilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Yöntem IPSC CMs (Şekil 6) uygulanan ilaçların elektrofizyolojik etkileri araştırmak için kullanılabilir. Burada, isoproterenol, non-selektif β-adrenoreceptor agonist dayak oranı (Şekil 6a) hızlı bir artış yol belirtildiği gibi kendiliğinden dayak IPSC-CMs için uygulandı. Farklı Isoproterenol konsantrasyonları IPSC-CMs dayak sıklığı etkisini gösteren bir doz-yanıt eğrisi Şekil 6bgösterilir.
Şekil 6: dayak frekans isoproterenol etkisi. (bir) kendiliğinden-dayak temsilcisi ham optik Aksiyon potansiyeli izlemeyi tek IPSC CM gösterilir. Isoproterenol (1 µM son bir konsantrasyon ile) IPSC-CMs için çubuğu tarafından gösterildiği gibi eklendi. (b) Bu doz-yanıt eğrisi farklı isoproterenol konsantrasyonları IPSC dayak sıklığı etkisini gösteriyor-CMs. hata çubukları temsil eden standart sapma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntemi APs optik bir kayıt belirli alt türü (yani, ventrikül benzeri hücreler) CMs insan iPSCs oluşturulan üzerinden sağlar. İnsan IPSC-CMs büyük çeşitli biyolojik ve tıbbi sorunları çözmek için ortaya çıkan bir araç, ve farklılaşma farklı CM alt türlerinden için deneysel değişkenlik önemli bir kaynağıdır. Belirli organizatörü öğeleri kullanarak, bir GEVI ifade özellikle optik yansıma sonra alt faiz, türünü temsil eden CMs içinde elde edilir.
APs başarılı edinimi tek IPSC-CMs den sonra ayrılma reseeding yoğunluğu üzerinde bağlıdır. Hücreleri çok yoğun reseeded Eğer izole tek IPSC-bir elektrik syncytium parçası olmayan CMs bulmak zaman alır. Ancak, çok düşük tohumlama yoğunlukları hücreleri yaşama olumsuz yönde etkiler. Böylece, farklı tohumlama yoğunlukları uyguladıkları bir test, özellikle yüksek üretilen iş görüntüleme üzerinde bağımlı olan deneyler yapan önce tavsiye edilir.
Resim alma sırasında VSFP sinyal-gürültü oranı, özellikle daha uzun deneyler sırasında olumsuz biçimde etkileyebilir photobleaching uğrar. Deneme sırasında hızlı photobleaching varsa, lütfen uyarma ışık çekim sadece resim alma sırasında veya olması gereken (arama ve VSFP ifade hücreleri üzerinde odaklanarak), gerekli hazırlık adımları sırasında açılan olun mümkün olduğunca çabuk yapılır. Buna ek olarak, en az miktar gerekli ışık uyarma gücünü azaltmak ve yapmak yüksek-duyarlı kamera resim alma için kullanılan dinamik aralığını kullanın.
ROI görüntü analizi sırasında çizerken IPSC-CMs kasılma sırasında hareket ve yatırım getirisini tüm görüntüleri görüntü yığını içinde kalmak gerekir unutmayın. VSFP ratiometric doğası gereği ROI hücreden herhangi bir hareketi için yapay sinyalleri yol değil ama sinyal kalitesini olumsuz etkileyebilir. Ancak, çok büyük ve aynı zamanda olumsuz gereksiz yere geniş sinyal üreten alanlar içeren ROIs sinyal-gürültü oranı etkiler ve kaçınılmalıdır.
En Temsilcisi sonuçlarıiçin en az 30 gün sonra kalp bir indüksiyon kullanılan olgun izin IPSC CMs farklı. Olgunlaşma bu sürenin sonunda, farklı CM alt türlerinden gibi nodal-, atriyal-, veya ventriküler benzeri hücreler ayırt. Bu hücreler hala olgunlaşmamış ve elektriksel özelliklerinin yanı sıra kalsiyum19işleme etkileyen iki boyutlu (2B) kültür sistemlerinde sadece bir embriyonik benzeri fenotip ulaşmak. Deneysel sonuçlar Aksiyon potansiyelleri ölçmek için kullanılan yöntemin bağımsız yıkmak gibi bu genel sınırlamalar IPSC-CMS dikkate alınması gerekir. Daha gelişmiş üç boyutlu (3-b) kültür sistemleri daha fazla olgunlaşma20doğru umut verici sonuçlar göstermiştir ve burada anlatılan yöntemi bu bağlamda değerli olabilir.
Geçerli altın standart ölçüm APs IPSC-CMS için farklı AP özellikleri çok detaylı bir analiz izin yama kelepçe kayıtları ve bile ölçüm tek iyon kanal akımları sağlar. Buna ek olarak, mutlak değerler (Örneğin, istirahat membran potansiyeli) ölçülebilir. Buna ek olarak, optik AP kayıtları membran potansiyeli göreli değişiklikler üzerinde temel alır. VSFP nispeten yavaş iç kinetik, nedeniyle "kaçmak" gibi belirli AP özellikleri okuma kör ve anlamlı Nefelometri AP upstroke hız gibi hızlı özellikleri mümkün değil. Ancak, bir tipik deneysel kurulumu, mutlak değerler ama değerleri (Örneğin, farklı hücre satırları arasındaki veya önce ve sonra bir ilaç uygulama) farklılıkları ölçülür. Bu güvenilir AP süresi gibi özellikleri bu yazılarda açıklanan optik yöntemi ile elde edilebilir (Örneğin, APD90 veya APD50) veya dayak oranı, bir çok daha yüksek aktarıma göre yama kelepçe10 ile . Ayrıca, bu teknoloji non-invaziv doğası aynı hücreyi birden çok ölçümleri saat10sağlar. Böylece, optik AP kayıtları ve yama kelepçe olmalı tamamlayıcı araçları olarak kabul ve cevaplanması gereken deneysel soru bağlı olarak kullanılır.
Optik AP kayıtları bir GEVI ifade veya bir potentiometric floresan boya (Örneğin, di-8-ANEPPs)21uygulama tarafından elde edilebilir. Floresan boyalar genellikle daha uygun floresan kinetik var ama onlar değil genetik olarak kodlanmış gibi belirli alt türü olan cardiomyocytes için yönetmen değil. Farklı çalışma ilkelerine dayanan GEVIs bir dizi gelişmiş22olmuştur. Burada, FRET tabanlı GEVI VSFP-CR11 kullanılır. Bu seçim için önemli bir neden yeşil flüoresan protein heyecanlı hangi hücresel depolarizasyon an artmak içinde kırmızı ve yeşil floresan bir azalma ile tepki verir bu gösterge, ratiometric vardı. Ratiometric bir göstergesi daha az duyarlı hücre hareketleri nedeniyle sadece bir değişiklik tarafından depolarization tepki göstergeleri daha cardiomyocytes kasılmalar nedeniyle yapılara kardiyoloji alanında avantajlı olmasıdır onların Floresan yoğunluğu.
Sadece ventrikül benzeri IPSC-CMs MLC2v artırıcı kullanarak hedefleme deney sonuçlarını burada sunulmuştur iken, atriyal veya düğüm-benzeri kullanarak farklı alt türü özel organizatörü öğeleri10CMs hedef de mümkündür. Yöntemi ayrıntılı olarak açıklamak için bu el yazması tek IPSC-AP özellikleri tek hücre analizi sağlar ve en yüksek sinyal gürültü oranı sunar bu bir cam coverslip üzerinde seribaşı CMs Imaging üzerinde duruldu. Ancak, bu teknoloji de bir elektrik syncytium veya 3-b bir yapı diğer hücreler ile entegre CMs görüntüleme sağlar. 3-b hücre kültür modelleri giderek kullanılan ve 2-B modelleri20farklı özellikleri sağlamak için gösterilen bu özel ilgi vardır. Görüntüleme kurulum ve ROIs tanımını bağlı olarak optik sinyalleri 3-b dokusunun geniş alanlar veya tek hücre doku içinde analiz edilebilir. Ayrıca, birden çok hücreye aynı anda görüntüsü olabilir ve ayrı ayrı analiz üretilen iş önemli bir artış yol açmaktadır.
Birlikte ele alındığında, burada sunulan Yöntem hızlı optik fenotipleme IPSC-CMS için ritim bozukluğu ile ilgili fenotipleri etkinleştirerek IPSC-CMs aritmi araştırma alanında uygulanabilirliği artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Alman Araştırma Vakfı (Si 1747/1-1), başka Kröner-Fresenius-Stiftung ve Deutsche Stiftung für Herzforschung gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
- Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research. Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).
- Rocchetti, M., et al. Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).
- Sinnecker, D., et al. Modeling long-QT syndromes with iPS cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).
- Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art. Life Sciences. , 98-113 (2016).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Den Hartogh, S. C., Passier, R. Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity. Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).
- Schweizer, P. A., et al. Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229 (2017).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Chen, Z., et al. Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes. European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2008).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).
- Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scientific Reports. 7, 5464 (2017).
- Dorn, T., et al. Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity. Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).
- Kaestner, L., et al. Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).
