Summary
Здесь мы представляем метод оптически изображение потенциалы действия, особенно в кардиомиоцитов желудочков как индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Метод основан на промоутер driven выражение напряжения чувствительных флуоресцентный белок.
Abstract
Cardiomyocytes, образующиеся человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC-CMs) являются инструментом, возникающих в сердечно-сосудистых исследований. Однородная популяция клеток, а iPSC-CMs, порожденных текущей дифференциация протоколы представляют собой смесь клеток с желудочковой-, предсердий-и узловые как фенотипы, которые усложняет фенотипические анализы. Здесь представлен метод для оптически записи потенциалы действия конкретно от желудочков как iPSC-CMs. Это достигается путем лентивирусные трансдукция с конструкцией, в которой генетически закодированный напряжения Индикатор находится под контролем элемента желудочков конкретной промоутера. Когда iPSC-CMs преобразованы с этой конструкции, датчик напряжения выражается исключительно желудочков подобных клеток, позволяя оптических мембраны подтип конкретных потенциальных записи с помощью микроскопии флуоресцирования промежуток времени.
Introduction
Кардиомиоцитов (CMs), производные от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) являются новым инструментом для рассечения молекулярных механизмов болезни сердца, расследовать Роман терапии и экран для сердца побочных эффектов1,2 ,3. С самого начала аритмогенная заболеваний, таких как channelopathies был важным направлением этой области исследования4. Следовательно методы расследования электрические фенотипы CMs, например аритмий или изменения в морфологии потенциал действия (AP), находятся в центре этой технологии.
Важным фактором в применении iPSC-CMs является, что текущие протоколы сердца дифференциация не приводят к однородная популяция клеток. Вместо этого они являются скорее смесь из клетки, напоминающие синусового узла, фибрилляция и желудочковая CMs на различных уровнях созревания5,6,,78. Эта разнородность может быть источником соответствующих экспериментальных изменчивости, особенно если исследованы параметры, такие как продолжительность AP (APD), который неразрывно различаются подтипы см (например, APD короче предсердий, чем в желудочковой CMs). Традиционный подход к решению этой проблемы является расследование одного iPSC-CMs, с помощью метода зажим патч и классифицировать каждой ячейки как узловой-, предсердий-, или желудочков как, на основе ее AP морфология9. Любой последующий анализ может быть затем ограничен в клетки, представляющие см подтип интерес. Основным недостатком данной стратегии является его ограниченной пропускной способности и отсутствие масштабируемости. Кроме того захватнический характер патч зажим электрофизиологии не позволяют изображений же клетки последовательно в течение длительного времени.
Здесь мы подробно экспериментальный метод10 , разработаны для оптически изображения APs в конкретных подтипы iPSC-CMs. Это преодолевает проблему неоднородности подтип и резко повышает пропускную способность по сравнению с традиционными методами, позволяя быстрое фенотипирование iPSC-CMs проведение генетических вариантов или в подверженными фармакологических агентов.
Обзор подтип-оптических изображений подход
Генетически закодированный напряжения Индикатор (GEVI), свойства которых флуоресценции изменить деполяризации и реполяризации клеточной мембраны, используется для оптически изображение изменения мембранного потенциала CMs. GEVI, здесь это напряжение зондирования флуоресцентный белок VSFP-CR11, которая состоит из напряжения зондирования трансмембранного домена сливается с парой Грин (клевер) и красный (mRuby2) флуоресцентный белок (рис. 1A). Благодаря близости двух флуорофоров возбуждения зеленого флуоресцентного белка приводит к небольшую часть энергии возбуждения, передаются в красных флуоресцентных белков через передачи энергии резонанса Фёрстер (лад). Таким образом возбуждения зеленого флуоресцентного белка приводит к эмиссии из зеленых и красных флуоресцентных белков (рис. 1A, верхняя группа). Когда клетки depolarizes, структурной перестройки датчика напряжения происходит что переводится в переориентации двух флуоресцентных белков, повышение эффективности ладу. Таким образом даже больше энергии возбуждения передается от зеленого до Красного флуоресцирующего белка (рис. 1A, Нижняя панель). В результате в ячейку деполяризованный, зеленая Флуоресценция выбросов диммер, и красной флуоресценцией выбросов ярче, чем в камере в отдыхая мембранного потенциала (рис. 1B).
Рисунок 1: оптическая томография мембранного потенциала с VSFP-ручей (A) A схема с изображением действий напряжения чувствительных флуоресцентный белок, проявленную VSFP-CR. При деполяризации мембраны клетки структурной перестройки в напряжение зондирования трансмембранных доменов переводит в переориентации Грин (ГПУП) и красный (RFP) флуоресцентный белок, повышение эффективности внутримолекулярной Фёрстер передача энергии резонанса (лад). (B) выбросов спектры VSFP после возбуждения GFP в клетках на мембранного потенциала покоя (Верхняя панель) и в деполяризованный клетках (Нижняя панель) изображены. Спектральные изменения при деполяризации преувеличен для ясности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Изменения в ладу эффективность зеркального отображения колебаний мембранного потенциала отражаются с помощью микроскопа флуоресценции оснащены изображения разделителя, который отделяет красной и зеленой флуоресценцией выбросов и проецирует их на две прилегающие районы Микросхема sCMOS камеры (рис. 2). С этой настройки флуоресценции выбросов на двух разных волны полосы могут быть записаны одновременно, что позволяет расчет коэффициента красно зеленая Флуоресценция отразить мембранного потенциала в каждом изображении покадровой серии.
Рисунок 2: Настройка системы,. Основные компоненты системы, используется для изображений, которые изображены спектральные изменения напряжения чувствительных флуоресцентный белок, зеркального отображения потенциальных изменений мембраны с высоким временным разрешением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Выражение VSFP-CR в CMs достигается лентивирусные трансдукции. Направлять проявление интереса к подтипу см, несущего содержит элемент промоутер ( MLC2v усилитель), который конкретно диски транскрипции в iPSC-CMs желудочков как10. Когда iPSC-CMs, которые представляют собой смесь предсердий как, узловой как и желудочков подобных клеток преобразованы с этой Лентивирусы, VSFP-CR выражается только в клетках желудочков как. Так как оптический потенциал действия изображений зависит от флуоресцентных датчик, записанные потенциалы действия исключительно представляют см подтип интерес (рис. 3).
Рисунок 3: промоутер управляемый VSFP выражение для подтипа специфические мембраны потенциал изображений. () Эта схема показывает, как достигаются cardiomyocyte оптический потенциал действия подтип конкретных записей. (b) iPSC-CMs инфицированных VSFP под контролем желудочков специфических MLC2v-усилитель показываются. Выражение датчика напряжения наблюдается только в желудочков как CMs в канале GFP (левая панель). Также предоставляются фазового контраста (средняя группа) и накладываемого изображения (правая панель). Белыми пунктирными линиями Марк границ ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка iPSC производные кардиомиоцитов изображений
Примечание: Методы для iPSC культуры и сердечных дифференциации были опубликованы до12,13,14 и здесь не обсуждаются подробно. Рекомендуется очищение iPSC-CMs ручного microdissection, разделения магнитных клеток или лактата выбор, в зависимости от дифференциации протокол, используемый. Для следующих протокола эксплантов microdissected от побоев областей, созданных с помощью монослоя дифференциация протокол13, были приняты на 15-й день сердца дифференциации и культивируемых до дня 30 фибронектин покрытием пластин, как описано до10.
- Возьмите клетки культуры пластин из инкубатора и вручную собирать сердца эксплантов в microcentrifuge трубок с помощью пипетки 200 мкл. После осаждения, аспирационная супернатанта культуры клеток и аккуратно помыть эксплантов, 2 x с Хэнком в сбалансированной соли раствора (HBSS).
- Отделить iPSC-CMs, добавив коллагеназы типа II (430 ед/мл в HBSS) и инкубировать их при 37 ° C за 30 мин.
- После того, как осаждение оставшихся крупноклеточный сгустки, собирать супернатанта, содержащий диссоциированных единого iPSC-CMs и добавить свежие см обслуживания носитель, содержащий высокий плода бычьим сывороточным (ФБС) концентрации (DMEM-F12, 20% FBS, 2 мм L-Glutamine, 1: 100 мкм несущественные аминокислот, 100 ед/мл пенициллин стрептомицином и β-меркаптоэтанол 0,1 мм).
- Если крупноклеточный сгустки остаются повторите диссоциации. Собрать один iPSC-CMs центрифугированием и Ресуспензируйте их в среде см с низкой концентрацией FBS (2% FBS).
- Повторное заполнение одного iPSC-CMs в плотности, позволяя последующей визуализации единичных клеток на 3,5 см стекло дно клетки культуры microdish, которая покрыта фибронектина (2 мкг/см2). Оптимизируйте плотность посева до участия в экспериментах высокой пропускной способности. Как правило 5 – 10 сердца эксплантов за 3,5 см блюдо достаточно; Однако это сильно зависит от размер экспланта и чистоты.
- Культура единого iPSC-CMs после их диссоциации в средстве обслуживания см, содержащий 2% FBS для по крайней мере 48 часов для обеспечения достаточного возмещения.
Примечание: В следующих шагах, iPSC-CMs преобразованы с человека, кодирование GEVI VSFP-CR под контролем MLC2v усилитель10 для достижения выражение GEVI желудочков конкретных. Кроме того лентивирусные конструкции, позволяя выразить GEVI специально в узловой или трепетания как клетки или неспецифических конструкции, укрывательство повсеместно выразил курьер промоутер, может быть используемые10. По запросу предоставляются лентивирусные плазмид.
Предупреждение: При работе с лентивирусные частиц, Обеспечьте условия труда уровень надлежащей биобезопасности, придерживаться инструкции по технике безопасности для работы с потенциально инфекционными агентами и принять необходимые меры предосторожности. - Подготовьте носитель инфекции путем смешивания человека10-содержащих клеточной культуры супернатанта, который был подготовлен в HEK293 клетках как описано до15, с среднего обслуживания CMs (см. шаг 1.3) в соотношении 1:1.
- Добавьте hexadimethrine бромида в конечной концентрации 8 мкг/мл для повышения эффективности инфекции.
Примечание: Из-за высокой инфекции эффективность iPSC-CMs до концентрации человека через ultracentrifugation обычно не является необходимым. - Аспирационная среднего обслуживания см от одного iPSC-CMs и заменить его с инфекции среднего, подготовленные в ходе шагов 1.7 и 1.8. Культура зараженных один iPSC-CMs в инфекции среднего за 12 ч при 37 ° C. Затем аспирационная среднего и заменить его снова среднего обслуживания см.
Примечание: Флуоресценции сигнала от GEVI появляется 48 часов после заражения. Визуализация мембраны потенциальных записей рекомендуется, 72 ч после инфекции в ближайшее время, для обеспечения надлежащего сигнала. Один зараженный iPSC-CMs может быть культивировали в течение 3 недель и образы последовательно. Если обширные Фотообесцвечивание происходит во время сеанса работы с образами, сигнал флуоресценции восстанавливает со временем. - До обработки изображений, Обмен клетки культуры среднего Tyrode в раствор с Ca2 + (135 мм NaCl, 5,4 мм KCl, MgCl 1 мм2, глюкоза 10 мм, 1.8 мм CaCl2и 10 мм HEPES; рН 7,35).
2. оптические мембраны потенциальных записей
- Место тепловизионные камеры, содержащие iPSC-CMs на сцене Перевернутый эпифлуоресцентного микроскопа с изображения разделителя, устанавливает соответствующий фильтр и камеры (например, sCMOS камера), способной высокоскоростной обработки изображений на высоком чувствительность.
Примечание: например, использование фильтрации 480/40 Нм полосовые возбуждения в сочетании с 500 Нм Лонг перевал дихроичное зеркало в Микроскоп, а 568 Нм Лонг перевал дихроичное зеркало в сочетании с 520/28 нм и 630/75 Нм полосовые фильтры выбросов в изображение разделителя. Для одной ячейки изображений, цель погружения высокого увеличения, высокой числовая апертура масло обеспечивает лучшее соотношение сигнал шум. - Если требуется электрической стимуляции, установите электроды стимуляции в тепловизионной камеры и подключите их к генератору стимул.
Примечание: Мы использовали ходить врезные, двумя платиновыми электродами и установлены в 3,5 см стекло дно клетки культуры блюда. Клетки, расположенные между электродами были образы. Типичные параметры стимуляции являются Прямоугольные импульсы 5 мс в срок, с амплитудой 10 расстояние между электродами V/см. - При необходимости используйте подогревом микроскопа для обеспечения стабильной температуры iPSC-CMs во время визуализации, или даже настройки камеры микроскопа инкубации, если долгосрочное изображений предназначен.
- Обратить внимание клетки и место клетки, выражая GEVI в центре поля просмотра.
Примечание: Наиболее удобно это делается с помощью окуляры микроскопа с помощью зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) или набор фильтров флуоресцентный белок (RFP) для выявления клеток, выражая GEVI красный. - Установите оптический путь так что испускаемого света направляется изображение разделителя. Переключить фильтр куб в Микроскоп к тому, чтобы сочетаться с фильтрами изображения разделителя (см. Таблицу материалы).
- В программном обеспечении управления камерой установите параметры приобретения так что высокоскоростной обработки изображений (например, 100 кадров в секунду, с выдержка 10 мс в кадре) Возможен экспорт.
Примечание: Как правило, это предполагает биннинга Камера пикселей (например, 8 x 8 пикселей камеры чип являются сегментирования генерировать один пиксел в промежуток времени фильма). - Настройте образ сплиттер согласно инструкции производителя. Два изображения, представляющие две полосы волны различных выбросов должно быть рядом друг с другом, каждый занимает одну половину изображения.
Примечание: Этот шаг должен быть выполнены только 1 x в начале каждой сессии изображений. - Проверить и, при необходимости, Отрегулируйте фокус изображения, производимые камеры.
- Отрегулируйте яркость освещения, чтобы избежать любой насыщенности пикселей; Это легче всего сделать с помощью цветовой палитры, в котором представлены насыщенных пикселей уникальный цвет.
Примечание: Во всех этих препаратов до изображений, ограничить воздействие образца к возбуждению света до необходимой суммы (т.е., не оставляйте свет на для продолжительных периодов времени) чтобы избежать Фотообесцвечивание GEVI. - Настройка на приобретение временных рядов (например, 5000 изображения 100 кадров в секунду для серии продолжительностью 50 s). Тусклый свет в комнате, (включая компьютерных мониторов) чтобы избежать рассеянный свет, влияния на измерение. Если свет затвора возбуждения не контролируется изображений программное обеспечение, открывайте его непосредственно перед запуском приобретения.
- Начните приобретение серии изображений. По желанию электрической стимуляции, начните ходить последовательность в соответствующее время точке, если он автоматически инициируется изображений программное обеспечение. Если требуется применение фармакологических агента, сделать это либо вручную (например, путем дозирования 100 мкл агента в десять раз конец концентрации к палате записи, содержащие 900 мкл буфера и осторожно смешивая его с пипеткой) или с помощью Константа потока перфузии системы.
- После завершения приобретения, закройте возбуждения света затвора при необходимости. Сохраните запись на жесткий диск.
- Оставляя неизменными параметры записи (то есть, время экспозиции, частоту и интенсивность света), выполнить запись флуоресценции фон (как в шаге 2.11) поверх региона coverslip, не содержащие клетки или другой coverslip, на котором не клетки были посеяны.
Примечание: Если последовательные измерения выполняются без изменения параметров приобретение, только один фон флуоресценции запись необходима для всех этих измерений. - При необходимости, выполните дополнительные эксперименты (шаги 2.4-2.13) на различных iPSC-CMs, расположенный на том же coverslip. Имейте в виду, что все CMs на coverslip будут затронуты в случае, если препарат был применен.
3. анализ
> Примечание: В зависимости от обработки изображений программное обеспечение используется (который обычно проприетарное программное обеспечение пакет, предоставляемый производителя камеры или весь флюоресценция системы), можно выполнить анализ полученных изображений частично или даже полностью в пределах этого программного пакета. Однако, здесь рабочего процесса анализа изображений, которые могут быть выполнены с открытым исходным кодом (то есть, изображение анализ платформы ImageJ)16, который может устанавливаться удобно с помощью распространения таких Фиджи17и пакет R для описаны статистические вычисления18 . Вкратце регионы интереса (ROI), представляющие клетки или фона отображаются в ImageJ, и среднее флуоресценции в этих ROIs со временем экспортируется в файл затем, далее анализироваться в R или, альтернативно, с электронной таблицы программным обеспечением.
- В программе обработки изображений сохранить или экспортировать полученное изображение временных рядов (записи, содержащие клетки и соответствующие записи фон) в формат (например, TIF), который может быть прочитан ImageJ. Кроме того используйте плагин BioFormats (https://imagej.net/Bio-Formats), который предусматривает процедуры, позволяя ImageJ читать несвободных форматов из различных марок производителей тепловизионные системы.
Примечание: Следующие шаги предполагают изображений интервалы же во время записи. Если это не так, это может быть необходимо экспортировать сведения о времени из изображений программное обеспечение и включить его в дальнейшем анализе. - Откройте стек TIF, содержащий ячейки в ImageJ.
- Используйте инструмент Выделение произвольной рисовать ROI над флуоресцентные cardiomyocyte красного канала. Убедитесь, что ROI достаточно большой, так что клетки не выбраться ROI во время Договаривающимися.
- Откройте менеджер плагин ROI ('анализ | Инструменты | ROI менеджер ') и нажмите на кнопку «Добавить [t]» добавить этот ROI как ROI1.
- Перетащите ROI за ту же ячейку в зелёном канале и добавьте этот ROI как ROI2.
- В ' анализ | Набор измерений меню, снимите все варианты, за исключением «Означает значение серого».
Примечание: Это должно быть сделано только 1 x в сеансе ImageJ. - В менеджере ROI, нажмите ' более | Multi мера ' кнопку. Выберите параметры «Измерить все срезы» и «Одну строку для каждого фрагмента» и нажмите «OK». Откроется окно, содержащее таблицу с тремя строками (номер слайса и среднее флуоресценции в двух трансформирования, представляющий ячейку в красный и зеленый канал, соответственно).
- Использование ' файл | Сохранить-как для сохранения таблицы в файл с разделителями-запятыми (CSV).
- Закройте окна с стека изображений и таблиц без закрытия окна диспетчера ROI. Откройте стек TIF, содержащий измерения фон.
- В менеджере ROI, нажмите ' более | Multi мера' кнопку. Выберите параметры «Измерить все срезы» и «Одну строку для каждого фрагмента» и нажмите «OK».
- Использование ' файл | Сохранить-как сохранить электронную таблицу с данными фон в другой файл CSV.
Примечание: Следующие вычисления можно сделать с электронной таблицы программным обеспечением. Мы использовали программного обеспечения R18. Простой пример сценария, который считывает данные ячейки и фона из файлов «cell.csv» и «background.csv» выполняет вычисления и участков время курс мембранный потенциал сигнала предоставляется в качестве дополнительного кода файл 1. - От фоновой записи, расчет средней интенсивности в красный и зеленый канал. Вычитание этого фонового сигнала от сигналов, представляющий ячейку в красный и зеленый канал для расчета ЗП, скорректированные по фону и GFP сигналов, соответственно.
- Как суррогат для мембранного потенциала Рассчитайте коэффициент RFP/GFP.
Примечание: Этот коэффициент безразмерные. Кроме того это могут быть нормированы его начальное значение (то есть,0ΔR/R). Важно отметить, что полезная информация содержится в временных изменений, а не в абсолютных значениях этого соотношения. Из-за неравномерного Фотообесцвечивание GFP и ППП может возникнуть базовых дрейф в этом соотношении. При необходимости, такие базовые дрейф могут быть исправлены путем создания базовой кривой и вычитания его из ППП/GFP соотношение10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В рисунке 4aпредставитель одного iPSC-CM изображен с белыми пунктирными линиями, маркировка ROI, обращается в ходе анализа изображений в ППП (слева) и канал GFP (справа). Сигнал от канала ППП показывает периодический рост в интенсивности флуоресценции во время потенциал каждого действия (рис. 4б, верхняя группа). Как описано во введении, это объясняется растущей ладу, вызванных изменениями в мембранного потенциала (рис. 1). Согласно GFP сигнала показывает периодические снижение интенсивности флуоресценции (рис. 4б, средняя группа). RFP/GFP отношение (рис. 4б, Нижняя панель) является биологическим сигнал, используемый в течению анализов, например APD50 и90 измерений РПО. Используя этот метод, 30-дневных желудочков как iPSC-CMs темп 439 ms (± 46 МС) и среднее APD90 (продолжительность 0,5 Гц, показали среднее APD50 (продолжительность с самого начала потенциал действия до завершения реполяризации на 50%) до 90% завершения реполяризации) из 520 ms (± 47 МС) (рис. 4 c).
Рисунок 4: принципы анализа изображения и характеристики основной потенциал действия. () одновременно зарегистрированных ППП (справа) и показано флуоресценции GFP (левая сторона) одного iPSC-см. Белый пунктирные линии представляют регионы интереса (ROI) для анализа изображений. (b) Raw следы фона исправлены ППП, GFP, и показаны RFP/GFP сигналов, полученных от ROI. (c) показаны средства и SEM APD90 и50 APD одного желудочка как iPSC-CMs при комнатной температуре и с 0,5 Гц ходить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Чтобы продемонстрировать, что этот метод способен также захвата изменения в продолжительности потенциала действия, iPSC-CMs были электрически стимулировали повышение ставки стимуляции, начиная от 0,4 до 2,5 Гц, увеличивая скорость каждые пять ударов (рис. 5). Рисунок 5aпоказан типичный оптически Записанная мембраны потенциальные сигнал от одного iPSC см. Первые четыре потенциалы действия каждой ставке избиения были среднем, демонстрируя прогрессивного сокращения потенциалы действия по увеличению избиение ставкам (Рисунок 5b). Усреднение последующих темп ударов является эффективным методом снижения шума, присущие оптически Записанная потенциалы действия10. Следует отметить, что изображены эксперимент не может захватить всю сумму ставки зависимых действий потенциал сокращения возможного, учитывая, что мы ходил в ячейку только пять ударов по каждой ходить ставке, которая не может быть достаточно для достижения равновесия.
Рисунок 5: влияние стимуляции частоты на продолжительность потенциал действия. () На повышение частоты, начиная от 0,4 до 2,5 Гц, как указано было темп iPSC-CM (единый электрических импульсов стимуляции представлены стрелками). (b) для каждого ходить частоты, усредненный AP рассчитывалась из первых четырех APs на этой частоте. Усредненное APs, выводятся как наложение, демонстрируя AP, сокращение с увеличением стимуляции ставки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Метод может также использоваться для изучения электрофизиологических эффекты препаратов, применяемых для iPSC-CMs (рис. 6). Здесь isoproterenol, агонист неизбирательной β-адренорецепторов, был применен к спонтанно избиение iPSC-CMs, как отмечается, ведет к быстрое увеличение частоты биений (рис. 6a). Показывается влияние различных концентраций Isoproterenol на частоту биений iPSC-CMs кривая доза ответ показан на рисунке 6b.
Рисунок 6: воздействие isoproterenol на частоту биений. показано () представитель сырой оптический потенциал действия трассировки спонтанно избиение одного iPSC см. Isoproterenol (с конечной концентрации 1 мкм) был добавлен в iPSC-CMs, как указано в баре. (b) этой кривой доза ответ показывает эффект концентрации различных isoproterenol на частоту биений iPSC-CMs. погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный здесь позволяет оптической записи APs от конкретного подтипом (например, желудочков подобных клеток) CMs, созданный из человека iPSCs. Человека iPSC-CMs являются новым инструментом решать огромное разнообразие биологических и медицинских проблем, и дифференциации в различные подтипы см является важным источником экспериментальной изменчивости. С помощью элементов конкретной промоутера, выражение GEVI специально достигается в CMs, представляющее подтип интересов, которые затем оптически отражаются.
Успешное приобретение APs от одного iPSC-CMs зависит от плотности reseeding после диссоциации. Если клетки являются заполнения слишком густой, это много времени, чтобы найти изолированные одного iPSC-CMs, которые не являются частью электрической синцития. Однако слишком низкой плотности посева негативно повлиять на выживание клетки. Таким образом систематическое тестирование различной плотности посева рекомендуется, особенно до участия в экспериментах, которые зависят от высок объём изображений.
Во время захвата изображений VSFP проходит Фотообесцвечивание, который может отрицательно сказаться на отношение сигнал шум, особенно во время больше экспериментов. Если быстрый Фотообесцвечивание присутствует во время эксперимента, пожалуйста, убедитесь, что возбуждения света затвор открыт только во время загрузки изображений или необходимые подготовительные шаги (Поиск и сосредоточение внимания на VSFP-выражая клетки), которые должны быть выполняются как можно быстрее. Кроме того, уменьшить мощность возбуждения света до минимальной суммы, необходимой и сделать использование динамического диапазона высок чувствительности камеры, используемые для захвата изображений.
При рисовании ROI в ходе анализа изображений, помните, что iPSC-CMs двигаться во время сжатия и должен оставаться в пределах ROI во всех изображениях стека изображений. Благодаря ratiometric характер VSFP любое движение клетки из ROI не приведет к искусственные сигналы, но может отрицательно повлиять на качество сигнала. Однако трансформирования, которые слишком велики и включают в себя излишне большие площади, не производящие сигнал также негативно влияют на отношение сигнал шум и его следует избегать.
Для Представителя результатыдифференцированные iPSC-CMs, которые позволили зрелым для по крайней мере 30 дней после того, как были использованы сердечной индукции. После этого периода созревания, различные см подтипов, такие как узловой-, предсердий-, или желудочков подобных клеток можно выделить. Эти клетки еще незрелой и достичь только фенотип эмбриональных как в системах двумерные (2-D) культуры, влияющих на электрические свойства, а также кальций, обработка19. Эти общие ограничения iPSC-CMs должны рассматриваться, как они могут сбить с толку экспериментальные результаты независимо от метода, используемого для измерения потенциалы действия. Более продвинутые системы трехмерной (3-D) культуры показали многообещающие результаты в направлении дальнейшего созревания20, и метод, описанный здесь может быть полезным в этом контексте.
Текущий золотой стандарт для измерения APs iPSC-CMs является патч зажим записей, которые позволяют очень подробный анализ различных характеристик AP и даже позволяет измерения токов канал одного иона. Кроме того абсолютные значения (например, отдыхая мембранного потенциала) может быть измерена. В отличие от оптической записи AP основаны на относительных изменений мембранного потенциала. Благодаря относительно медленные встроенные кинетика VSFP определенные AP характеристики, такие как «выброс», может быть затуплены от чтения, и значимые количественный быстро функций, таких как скорость (рубильный) станок ЗС, не возможна. Однако в типичной экспериментальной установки, измеряются не абсолютные величины, но различия значений (например, между различными клеточных линий или до и после применения препарата). Это может быть надежно достигнуто с оптическим методом, описанным в этой рукописи для характеристики, как продолжительность AP (например, РПО90 или APD50) или избиение ставка, с гораздо более высокую пропускную способность по сравнению с патч зажим10 . Кроме того неинвазивный характер этой технологии позволяет несколько измерений и той же клетке время10. Таким образом оптической записи AP и патч зажим следует рассматривать как дополнительные инструменты и используются в зависимости от экспериментальных вопрос, который необходимо ответить.
Оптической записи AP может быть достигнуто либо путем выражения GEVI применения потенциометрическое флуоресцентные краски (например, ди-8-ANEPPs)21. Краски люминесцентные, флуоресцентные имеют обычно выгоднее флуоресценции кинетики но не могут быть направлены на определенный подтип кардиомиоцитов, как они не генетически кодируются. Количество Гевиш, основанные на разных принципах были развитые22. Здесь на базе лад GEVI VSFP-CR11 используется. Основной причиной этого выбора было ratiometric характер этого показателя, который реагирует на сотовой деполяризации с увеличением в красный и снижение в зеленой флуоресценцией, если Зеленый флуоресцирующий белок спешит. Это выгодно в области кардиологии, потому что такой индикатор ratiometric меньше подвержены артефактов, вызванных ячейки движения из-за сужения кардиомиоцитов, чем показатели, которые реагируют на depolarization только путем изменения их интенсивность флуоресценции.
Хотя здесь представлены только результаты экспериментов, ориентация желудочков как iPSC-CMs с помощью MLC2v усилитель, это также возможно ориентироваться предсердий - или узловой как CMs с помощью различных подтипа конкретной промоутера элементы10. Для описания метод детально, этот манускрипт сосредоточена на визуализации одного iPSC-CMs, которые были посеяны на coverslip стекла, как это дает анализ свойств AP одиночных клеток и обеспечивает высокий коэффициент сигнал шум. Однако эта технология также позволяет изображений CMs, которые интегрированы с другими клетками электрической синцития или трехмерной структуре. Это особый интерес как культура модели 3-D клеток все шире используются и было показано, чтобы предоставить свойства отличается от модели 2-D20. В зависимости от настройки изображений и определение Руа оптические сигналы могут быть проанализированы из крупных районов 3-D ткани или из одной клетки в ткани. Кроме того, несколько ячеек может быть воспроизведен образ одновременно и проанализированы отдельно, привело к значительному увеличению пропускной способности.
Взятые вместе, метод, представленные здесь может улучшить применимость iPSC-CMs в области исследования аритмии, позволяя быстрое оптических фенотипирование iPSC-CMs для связанных с аритмии фенотипов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантов от немецкого фонда научных исследований (Si 1747/1-1), остальное Kröner-Fresenius-Stiftung и Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
- Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research. Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).
- Rocchetti, M., et al. Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).
- Sinnecker, D., et al. Modeling long-QT syndromes with iPS cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).
- Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art. Life Sciences. , 98-113 (2016).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Den Hartogh, S. C., Passier, R. Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity. Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).
- Schweizer, P. A., et al. Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229 (2017).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Chen, Z., et al. Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes. European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2008).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).
- Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scientific Reports. 7, 5464 (2017).
- Dorn, T., et al. Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity. Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).
- Kaestner, L., et al. Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).
