Summary
Här presenterar vi en metod för att optiskt bild handlingspänningar, särskilt i ventrikulära-liknande inducerade pluripotenta stamceller-derived hjärtmuskelcellerna. Metoden är baserad på arrangören-driven uttrycket av en spänningskänsliga fluorescerande protein.
Abstract
Hjärtmuskelcellerna genereras från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSC-CMs) är ett framväxande verktyg i kardiovaskulär forskning. Snarare än att vara en homogen population av celler, iPSC-CMs genereras av nuvarande differentiering protokoll representerar en blandning av celler med ventrikulära-, förmaks-, och nodal-liknande fenotyper, vilket komplicerar fenotypiska analyser. Här presenteras en metod för att optiskt rekord handlingspänningar specifikt från ventrikulära-liknande iPSC-CMs. Detta uppnås genom lentiviral transduktion med en konstruktion där en genetiskt-kodade spänningsindikator är under kontroll av en ventrikulär-specifika promotorn element. När iPSC-CMs är sensorik med denna konstruktion, uttrycks spänningssensor uteslutande i ventrikulära-liknande celler, aktivera subtyp-specifika optiska membran potentiella inspelningar med time-lapse fluorescensmikroskopi.
Introduction
Hjärtmuskelcellerna (CMs) härrör från inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är ett framväxande verktyg att dissekera molekylära mekanismer av hjärtsjukdom, att undersöka nya terapier, och till skärmen för kardiella biverkningar effects1,2 ,3. Rätt från början, har Högerkammarfunktion sjukdomar såsom channelopathies varit ett viktigt fokus för denna forskning område4. Metoder för att undersöka elektriska fenotyper av CMs, såsom arytmier eller förändringar i aktionspotential (AP) morfologier, är således kärnan i denna teknik.
En viktig faktor i tillämpningen av iPSC-CMs är att nuvarande hjärt differentiering protokoll inte resulterar i en homogen population av celler. Istället, de är snarare en blandning av celler som liknar sinusknutan, förmaksflimmer, och ventrikulära CMs på olika nivåer av mognad5,6,7,8. Denna heterogenitet kan vara en relevant källa av experimentell variationer, särskilt om parametrar såsom AP varaktighet (APD) undersöks, som intimt skiljer sig mellan CM subtyper (t.ex., APD är kortare i förmaksflimmer än i ventrikulära CMs). Den konventionella metoden för att lösa problemet är att undersöka enda iPSC-CMs med metoden för patch-clamp och klassificera varje cell som nodal-, förmaks-, eller ventrikulär-liknande, baserat på dess AP morfologi9. Eventuella efterföljande analys kan då begränsas till cellerna som representerar CM subtyp av intresse. Den stora nackdelen med denna strategi är dess begränsade genomströmning och avsaknaden av skalbarhet. Dessutom tillåter inte invasiva arten av patch clamp elektrofysiologi bildtagning av samma celler sekventiellt över längre tidsperioder.
Här tillhandahåller vi experimentella Detaljer om en metod10 utvecklade för att optiskt bild APs i specifika subtyper av iPSC-CMs. Detta övervinner problemet subtyp heterogenitet och ökar dramatiskt genomströmningen jämfört med konventionella metoder, så att den snabba fenotypning av iPSC-CMs bär genetiska varianter eller att vara utsatt för farmakologiska agenter.
Översikt av subtyp-specifika optisk imaging strategi
En genetiskt-kodade spänningsindikator (GEVI), vars fluorescens egenskaper ändras vid depolarisation och repolarisering av cellmembranet, används för att optiskt bild förändringar av membranet potential av CMs. Den GEVI tillämpas här är det spänningsavkännande fluorescerande proteinet VSFP-CR11, som består av en spänningsavkännande transmembrana domän smält till ett par en grön (klöver) och en röd (mRuby2) fluorescerande protein (figur 1A). På grund av närheten av de två fluorophores, excitation av grönt fluorescerande protein resulterar i en bråkdel av magnetiseringen energin överförs till den röda fluorescerande protein via Förster resonans energiöverföringen (bandet). Därför, excitation av grönt fluorescerande protein resulterar i utsläpp från både gröna och de röda fluorescerande proteinerna (figur 1A, övre panelen). När cellen depolarizes, uppstår en strukturell ombildning av spänning sensorn som översätter till en omorientering av de två fluorescerande proteiner, effektivisering bandet. Således överförs ännu mer av energin som excitation från gröna till röda fluorescerande proteinet (figur 1A, nedre panelen). Som ett resultat, i en Aricebo cell, grön fluorescens utsläpp är dimmer och röd fluorescens utsläpp är ljusare än i en cell på Vila membranpotential (figur 1B).
Figur 1: optisk avbildning av membranpotential som med VSFP-CR. (A) A Schematisk föreställande åtgärden av spänningskänsliga fluorescerande protein VSFP-CR visas. Vid depolarisation av cellmembranet översätter en strukturell ombildning i domänen spänningsavkännande transmembrana till en omorientering av den gröna (GFP) och röd (RFP) fluorescerande protein, öka effektiviteten i de intramolekylära Förster resonans energiöverföringen (bandet). (B) utsläpp spektra av en VSFP vid excitation av GFP i celler på vilande membranpotentialen (övre panelen) och i Aricebo celler (nedre panelen) skildras. Den spektrala ändringen vid depolarisation är överdriven tydlighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Förändringar i bandet effektivitet spegling växlingarna av membranet potential är avbildade med fluorescens Mikroskop utrustat med en bild-splitter, som skiljer röd och grön fluorescens utsläpp och projekt dem på två angränsande områden i chip av en sCMOS kamera (figur 2). Med denna uppsättning, kan fluorescens utsläpp på två olika våglängd band spelas in samtidigt, vilket gör att beräkningen av en kvot på röd-till-grön fluorescens att återspegla membranet potential i varje bild av en time-lapse serie.
Figur 2: konfiguration av bildgivande systemet. De huvudsakliga komponenterna av bildgivande systemet brukade bild spektrala ändringarna av spänningskänsliga fluorescerande protein spegling membran potentiella ändringar på en temporal högupplöst skildras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Uttrycket av VSFP-CR i CMs uppnås genom lentiviral transduktion. För direkt intresseanmälan till undertypen CM, innehåller lentivirus ett arrangören element (den MLC2v förstärkare) som specifikt driver transkription i ventrikulära-liknande iPSC-CMs10. När iPSC-CMs som representerar en blandning av förmaksflimmer-liknande, nodal-liknande och ventrikulära-liknande celler är sensorik med denna lentivirus, uttrycks VSFP-CR endast i ventrikulära-liknande celler. Eftersom den optiska aktionspotential imaging beror på denna fluorescerande sensor, representerar de inspelade handlingspänningar uteslutande CM subtyp av intresse (figur 3).
Figur 3: arrangören-driven VSFP uttryck för subtyp-specifika membran potentiella imaging. (en) Detta schema visar hur hjärtmuskelcellen subtyp-specifika optiska aktionspotential inspelningar uppnås. (b) iPSC-CMs infekterade med en VSFP under kontroll av den ventrikulära-specifika MLC2v-förstärkare visas. Ett uttryck för spänningssensor observeras bara i ventrikulära-liknande CMs i GFP-kanalen (vänster). Faskontrast (mellersta panelen) och överlägg bild (höger panel) finns också. De vita streckade linjerna markerar cellgränserna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av iPSC-derived hjärtmuskelcellerna för avbildning
Obs: Metoder för iPSC kultur och hjärt differentiering har publicerats före12,13,14 och diskuteras inte här i detalj. Rening av iPSC-CMs av manuell lokalt, magnetiska cellseparation eller laktat urval rekommenderas, beroende på det differentiering-protokoll som används. För följande protokoll, microdissected bladsticklingar från slå områden, genereras med hjälp av en enskiktslager differentiering protokoll13, togs på dag 15 av en hjärt differentiering och odlade fram till dag 30 på Fibronektin-belagda plattor som beskrivs före10.
- Ta cellen kultur plattor ur inkubatorn och manuellt samla de kardiella bladsticklingar i mikrocentrifugrör med 200 µL pipett. Efter sedimentering, sug ut supernatant cellkulturen och försiktigt tvätta de bladsticklingar 2 x med Hank är balanserad salt lösning (HBSS).
- Separera iPSC-CMs genom att lägga till kollagenas typ II (430 U/mL i HBSS) och inkubera dem vid 37 ° C i 30 min.
- När sedimentation av cellen återstående stora klumpar, samla in supernatanten som innehåller dissocierade enda iPSC-CMs och lägga detta till färska CM underhåll medium som innehåller en hög fetalt bovint serum (FBS) koncentration (DMEM-F12, 20% FBS, 2 mM L-Glutamine, 1: 100 MEM icke-essentiella aminosyror, 100 U/mL penicillin-streptomycin och 0,1 mM β-merkaptoetanol).
- Upprepa dissociation om stora cell klumpar kvar. Samla inre iPSC-CMs genom centrifugering och återsuspendera dem i CM medium innehållande en låg FBS-koncentration (2% FBS).
- Uppehållen enda iPSC-CMs i en täthet så att den efterföljande avbildning av enstaka celler på en 3,5 cm glasbotten cell kultur microdish som har varit belagd med Fibronektin (2 µg/cm2). Optimera sådd tätheten innan de inleder hög genomströmning experiment. Vanligtvis är 5 – 10 hjärt bladsticklingar per 3,5 cm skålen tillräcklig. dock beror detta mycket på explant storlek och renhet.
- Kultur de enda iPSC-CMs efter deras dissociation i CM underhåll medium innehållande 2% FBS för minst 48 h att säkerställa en tillräcklig återhämtning.
Obs: I nästa steg, är iPSC-CMs sensorik med ett lentivirus kodning GEVI VSFP-CR under kontroll av en MLC2v förstärkare10 för att uppnå en ventrikulär-specifika GEVI uttryck. Alternativt kan lentiviral konstruktioner som gör det möjligt för att uttrycka GEVI specifikt i nodal - eller förmaksflimmer-liknande celler eller en ospecifik konstruktion som härbärgerat ubiquitously uttryckta PGK arrangören, vara begagnade10. Lentiviral plasmider finns tillgängliga på begäran.
Varning: När du arbetar med lentiviral partiklar, se till att arbetsmiljön har tillräcklig biosäkerhet nivå, följa säkerhetsanvisningarna för att arbeta med potentiellt infektiösa agens, och vidta nödvändiga säkerhetsåtgärder. - Förbered det infektion mediet genom att blanda de lentivirus10-innehållande cellkultur supernatant, som har producerats i HEK293 celler som beskrivs innan15, med CMs underhåll medium (se steg 1.3) i förhållandet 1:1.
- Lägg till hexadimethrine metylbromid med en slutlig koncentration på 8 µg/mL att effektivisera infektion.
Obs: På grund av den höga infektionen effektivitet av iPSC-CMs tidigare koncentration av lentivirus genom ultracentrifugering är oftast inte nödvändigt. - Aspirera CM underhåll mediet från de enda iPSC-CMs och ersätta det med infektion medium förbereddes under steg 1.7 och 1.8. Kultur de infekterade enda iPSC-CMs infektion medium för 12 timmar vid 37 ° C. Sedan aspirera på medellång och ersätta det igen med CM underhåll medium.
Obs: En fluorescens signal från GEVI visas 48 h efter infektionen. En avbildning av membranet potential inspelningarna rekommenderas, 72 h efter infektion tidigast att säkerställa en korrekt signalstyrka. Enstaka smittade iPSC-CMs kan vara odlade i minst 3 veckor och avbildas sekventiellt. Om omfattande fotoblekning uppstår under en bildsession, återvinner fluorescens signalen över tid. - Innan imaging, utbyta cellodlingsmedium av Tyrodes lösning kompletteras med Ca2 + (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM glukos, 1,8 mM CaCl2och 10 mM HEPES; pH 7,35).
2. optiska membran potentiella Recordings
- Placera imaging kammaren som innehåller iPSC-CMs på scenen av en inverterad epifluorescensmikroskop utrustad med en bild-splitter, den lämpliga filter set och en kamera (t.ex., en sCMOS kamera) kan av höghastighetsfilmning på en hög känslighet.
Obs: till exempel använder en 480/40 nm band-passera excitation filtrera i kombination med en 500 nm lång-pass dichroic spegel i mikroskopet, och en 568 nm lång-pass dichroic spegel kombinerat med 520/28 nm och 630/75 nm band-passera utsläpp filter i image splitter. För enskild cell imaging ger en hög förstoring, hög-numeriska-bländare oljeimmersionsobjektivet det bästa signal-brus-förhållandet. - Om elektrisk stimulering krävs, installera pacing elektroder i imaging kammaren och ansluta dem till en stimulans generator.
Obs: Vi använde en pacing infälld som innehöll två platina elektroder och monterade in 3,5 cm glasbotten cell kultur rätter. Cellerna ligger mellan elektroderna var avbildade. Typiska pacing parametrar är rektangulära pulser med 5 ms i varaktighet, med en amplitud på 10 V/cm elektrod avstånd. - Använd eventuellt en uppvärmd Mikroskop scenen för att garantera en stabil temperatur i iPSC-CMs under imaging, eller ens en Mikroskop inkubation kammare set-up om långsiktiga imaging är avsedd.
- Få cellerna att fokusera och placera en cell som uttrycker GEVI in i mitten av fältet visning.
Obs: Detta görs enklast med hjälp av okularen av mikroskopet med ett grönt fluorescerande protein (GFP) eller en röd fluorescerande protein (RFP) filtret inställt för att identifiera celler som uttrycker GEVI. - Ange den optiska vägen så att utsända ljus dirigeras till image splitter. Byta filter kuben i mikroskopet till en att kombineras med filtren i image splitter (se Tabell för material).
- I programvaran styra kameran, ställa in förvärv så att av höghastighetsfilmning (t.ex., 100 bilder per sekund, med en exponeringstid på 10 ms per bildruta) är möjligt.
Obs: Oftast, detta innebär att den binning kamera pixlar (t.ex., 8 x 8 pixel kamera chip är kastas i papperskorgen för att generera en pixel i den time-lapse filmen). - Ställa in image splitter enligt tillverkarens anvisning. De två bilderna som representerar två olika utsläpp våglängd band bör vara intill varandra, varje ockuperar en halvan av bilden.
Obs: Detta steg måste vara utförs endast 1 x i början av varje bildsession. - Kontrollera och vid behov justera fokus för den bild som produceras av kameran.
- Justera ljusstyrkan på belysningen ljuset så att någon mättnad av pixlarna undviks. Detta kan enklast göras med en färgpalett som mättade pixel representeras av en unik färg.
Obs: Under alla dessa preparat före imaging, begränsa exponering av provet för magnetiseringen ljus till mängden som krävs (dvs., inte lämna lampan på för längre perioder) att undvika fotoblekning av GEVI. - Ställa in förvärvet av tidsserierna (t.ex., 5 000 bilder med 100 bildrutor per sekund för en serie 50 s). Dämpa ljuset i rummet (inklusive datorskärmar) för att undvika ströljus som påverkar mätningen. Om magnetiseringen ljus slutaren inte styrs av avbildningsprogrammet, öppnar du den precis innan förvärvet.
- Starta förvärvet av image-serien. Om elektriska pacing önskas, börja sekvensen pacing vid lämplig tidpunkt punkt, såvida inte det initieras automatiskt av avbildningsprogrammet. Om tillämpningen av en farmakologisk agent är ville, göra detta antingen manuellt (t.ex., av pipettering 100 µL av agenten i en tiofaldig slutet koncentration till inspelning avdelningen innehåller 900 µL buffert och försiktigt blanda det med pipetten) eller med hjälp av en konstant flöde perfusion system.
- När förvärvet är klar, Stäng excitation ljus slutaren vid behov. Spara inspelningen till hårddisken.
- Lämnar inspelningsinställningar (dvs, exponeringstid, bildhastighet och ljusintensiteten) oförändrad, utföra en inspelning av den bakgrunden fluorescensen (som i steg 2.11) över en region i den täckglas som inte innehåller celler eller över en annan täckglas som inte celler har varit seedade.
Obs: Om sekventiella mätningar utförs utan att ändra inställningarna för förvärv, endast en bakgrund fluorescens inspelning är nödvändigt för alla dessa mätningar. - Om du vill utföra ytterligare experiment (steg 2,4 – 2,13) på olika iPSC-CMs ligger på de samma täckglaset. Tänk på att alla CMs på täckglaset kommer att påverkas om en drog var tillämpas.
3. analys
> Obs: Beroende på avbildningsprogrammet används (som vanligtvis är en proprietär programvarupaket som tillhandahålls av tillverkaren av kameran eller hela fluorescensen imaging system), det kan vara möjligt att utföra analys av förvärvade bilderna delvis eller till helt inom detta programpaket. Dock här ett arbetsflöde för bildanalys som kan utföras med öppen källkod (dvsbild analys plattformen ImageJ)16, som kan installeras enkelt med en distribution som Fiji17och R paketet för statistiska computing18 beskrivs. Kort, regioner av intresse (ROIs) som representerar celler eller bakgrunden dras i ImageJ, och genomsnittlig fluorescensen i dessa ROIs över tid exporteras till en fil, sedan ytterligare analyseras i R eller, alternativt, med kalkylprogram.
- I avbildningsprogrammet, Spara eller exportera förvärvade bild tidsserierna (både inspelningen som innehåller celler och den motsvarande bakgrunden inspelningen) till ett format (t.ex., TIF) som kan läsas av ImageJ. Alternativt använda insticksmodulen BioFormats (https://imagej.net/Bio-Formats), som föreskriver rutiner som möjliggör ImageJ läsa proprietära filformat från olika märken av imaging systemtillverkare.
Obs: Följande åtgärder förutsätter att imaging intervallen är densamma under hela inspelningen. Om detta inte är fallet, kan det vara nödvändigt att exportera information till timing från avbildningsprogrammet och inkludera det i den vidare analysen. - Öppna TIF stacken som innehåller celler i ImageJ.
- Använd verktyget frihand markering för att rita en ROI över en fluorescerande hjärtmuskelcellen i den röda kanalen. Säkerställa att ROI är tillräckligt stor så att cellen inte flytta ur ROI samtidigt.
- Öppna den ROI manager plugin ('analysera | Verktyg | ROI Manager') och tryck på knappen 'Add [t]' att lägga till denna ROI som ROI1.
- Dra ROI över samma cell i den gröna kanalen och lägga denna ROI som ROI2.
- I ' analysera | Ange mått menyn, avmarkera alla alternativ utom 'Medelvärde grå'.
Obs: Detta måste göras endast 1 x i en ImageJ-session. - I ROI manager, tryck på ' mer | Multi åtgärd ' knappen. Välj alternativen 'Mäta alla skivor' och 'En rad per skiva' och tryck på 'OK'. Ett fönster öppnas som innehåller ett kalkylblad med tre rader (antalet segment och den genomsnittliga fluorescensen i de två ROIs representerar cellen i röda och den gröna kanalen, respektive).
- Använd ' fil | Spara som att spara kalkylbladet i en kommaavgränsade värden (CSV) fil.
- Stäng fönstret med en bildstapel och kalkylblad utan att stänga fönstret ROI manager. Öppna TIF stacken som innehåller bakgrund mätningen.
- I ROI manager, tryck på ' mer | Multi åtgärd' -knappen. Välj alternativen 'Mäta alla skivor' och 'En rad per skiva' och tryck på 'OK'.
- Använd ' fil | Spara som att spara kalkylbladet med bakgrundsuppgifter till en CSV-fil.
Obs: Följande beräkningar kan göras med kalkylprogram. Vi använde den R programvara18. Ett enkelt exempelskript som läser den cellen och bakgrunden datafrån från filer ”cell.csv” och ”background.csv” utför beräkningarna och tomter tidsförloppet för membran potentiella signalen ges som kompletterande kod fil 1. - Från bakgrunden inspelning, beräkna genomsnittliga intensiteten i röda och den gröna kanalen. Subtrahera denna bakgrund signal från de signaler som representerar cellen i den röda och gröna kanalen att beräkna bakgrundskorrigerade RFP och god Jordbrukarsed signaler, respektive.
- Som ett surrogat för membranpotentialen, beräkna förhållandet RFP/GFP.
Obs: Detta förhållande är dimensionslös. Alternativt kan det normaliseras till sitt ursprungliga värde (dvs., ΔR/R0). Allt innehåller användbar information i de tidsmässiga förändringarna i stället för de absoluta värdena för detta förhållande. På grund av ojämn fotoblekning GFP och på RFP, kan en baslinje drift i detta förhållande uppstå. Om det behövs får sådan en baslinje drift korrigeras genom att konstruera en baslinje kurva och subtrahera det från RFP/GFP baserat på10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 4aavbildas en representativ enda iPSC-CM med de vita streckade linjerna märkning ROI dras under bildanalys i på RFP (vänster sida) och kanalen GFP (höger sida). Signalen från RFP kanalen visar en periodisk ökning i fluorescerande intensitet under varje aktionspotential (figur 4b, övre panelen). Som beskrivits i inledningen, beror detta på en ökande bandet som orsakas av förändringar i membranet potential (figur 1). Konkurrenslagen, visar GFP signalen en periodisk minskning i fluorescerande intensitet (figur 4b, mellersta panelen). RFP/GFP förhållandet (figur 4b, nedre panelen) är den biologiska signal som används i efterföljande analyser, såsom APD50 och APD90 mätningar. Med hjälp av denna metod, 30-dag-gammal ventrikulära-liknande iPSC-CMs tempo vid 0,5 Hz visade en genomsnittlig APD50 (varaktighet från början av action potential förrän repolarisering är klar med 50%) av 439 ms (± 46 ms) och en genomsnittlig APD90 (varaktighet tills repolarisering kompletteras av 90%) av 520 ms (± 47 ms) (figur 4 c).
Figur 4: principerna för bildanalys och grundläggande aktionspotential egenskaper. (en) den samtidigt inspelade RFP (höger sida) och god Jordbrukarsed (vänster sida) fluorescens av en enda iPSC-CM visas. De vita streckade linjerna representerar områdena av intresse (ROI) används för imaging analysen. (b) Raw spår av bakgrundskorrigerade RFP, GFP, och RFP/GFP signaler härrör från ROI visas. (c) medel och SEM av APD90 och APD50 för enda ventrikulära-liknande iPSC-CMs i rumstemperatur och med 0,5 Hz pacing visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att visa att metoden är också kapabel att fånga förändringar i aktionspotentialens duration, var iPSC-CMs stimuleras elektriskt öka stimulering priser varierar från 0,4 till 2,5 Hz, öka varje fem beats (figur 5). En typisk optiskt-inspelade membran potentiella signalen från en iPSC-CM visas i figur 5a. De fyra första handlingspänningar varje slå takt var i genomsnitt, visar en progressiv förkortning av handlingspänningar ökad misshandeln och billigt (Figur 5b). Genomsnitt efterföljande tempo beats är en effektiv metod att minska buller inneboende till optiskt-inspelade handlingspänningar10. Det bör nämnas att den avbildade experimentet inte kan fånga hela mängden ränta-beroende aktionspotential förkorta möjligt, med tanke på att vi tempo cellen för endast fem slag på varje pacing skattesats, vilket inte kanske är tillräckligt för att nå jämvikt.
Figur 5: effekten av pacing frekvensen på aktionspotentialens duration. (en) En iPSC-CM var tempo öka frekvenserna varierar från 0,4 till 2,5 Hz som anges (de enda elektriska pacing pulserna representeras av pilar). (b) för varje pacing frekvens, en i genomsnitt AP beräknades från de fyra första APs på denna frekvens. I genomsnitt APs ritas som överlagring, visar AP förkorta med ökande pacing priser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Metoden kan också användas för att undersöka elektrofysiologiska effekter av läkemedel tillämpas till iPSC-CMs (figur 6). Här, tillämpades isoproterenol, en icke-selektiv β-stimulerande agonist, spontant-slog iPSC-CMs som anges, vilket leder till en snabb ökning i misshandeln (figur 6a). En dos-respons kurva som visar effekten av olika Isoproterenol koncentrationer på stryk frekvensen för iPSC-CMs visas i figur 6b.
Figur 6: effekten av isoproterenol på stryk frekvensen. (en) representativa raw optiska aktionspotential spårning av spontant-stryk enda iPSC-CM visas. Isoproterenol (med en slutlig koncentration på 1 µM) lades till iPSC-CMs som indikeras av baren. (b) denna dos-respons kurva visar effekten av olika isoproterenol koncentrationer på stryk frekvensen av iPSC-CMs. felstaplar representera standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs här kan en optisk inspelning av APs från en specifik undertyp (dvs, ventrikulär-liknande celler) av CMs som genereras från iPSCs mänskliga. Mänskliga iPSC-CMs är ett framväxande verktyg att hantera en enorm mängd biologiska och medicinska problem och differentiering till CM subtyperna är en viktig källa till experimentella variabilitet. Genom att använda specifika promotorn element, uppnås specifikt uttryck för ett GEVI CMs som representerar subtyp av intresse, som sedan är optiskt avbildad.
Framgångsrika förvärv av APs från enda iPSC-CMs beror på reseeding tätheten efter dissociation. Om cellerna är nämligen alltför tät, är det tidskrävande att hitta isolerade enda iPSC-CMs som inte är del av en elektrisk syncytium. Dock påverka alltför låg sådd tätheter negativt överlevnaden av cellerna. Således, en systematisk testning av olika sådd densitet rekommenderas, speciellt innan de inleder experiment som är beroende av hög genomströmning imaging.
Under bild förvärv genomgår VSFP fotoblekning, som negativt kan påverka det signal-brus-förhållandet, speciellt under längre experiment. Om snabb fotoblekning är närvarande under experimentet, se till att magnetiseringen ljus slutaren är endast öppen under bild förvärv eller nödvändiga förberedelser (söka efter och fokusera på VSFP-uttryckande celler), som bör vara utförs så snabbt som möjligt. Dessutom minskar kraften av magnetiseringen ljus till det minimala beloppet och göra använda av det dynamiska omfånget av högkänsliga kameran används för bild förvärv.
När du ritar ROI under bildanalys, vara medvetna att iPSC-CMs flytta under kontraktion och ska bo inom ROI i alla bilder av en bildstapel. Sin grund proportionerlig i VSFP, varje förflyttning av cellen av ROI leder inte till konstgjorda signaler men kan negativt påverka signalkvaliteten. Dock ROIs som är alltför stora och inkluderar onödigt stor icke-signal-producerande områden också negativt påverka det signal-brus-förhållandet och bör undvikas.
Differentierade iPSC-CMs som har tillåtits att mogna i minst 30 dagar efter en hjärt induktion har använts för Representativa resultat. Efter denna period av mognad, olika CM subtyper, såsom nodal-, förmaks-, eller ventrikulär-liknande celler kan särskiljas. Dessa celler är fortfarande omogen och nå endast en embryonal-liknande fenotyp i tvådimensionell (2D) kultur system som påverkar elektriska egenskaper samt kalcium hantering19. Dessa allmänna begränsningar för iPSC-CMs måste övervägas, eftersom de kan blanda ihop experimentella resultat oberoende av vilken metod som används för att mäta handlingspänningar. Mer avancerade tredimensionell (3-D) kultur system har visat lovande resultat mot ytterligare mognaden20, och den metod som beskrivs här kan vara värdefulla i sammanhanget.
Nuvarande guldmyntfoten för mäta APs för iPSC-CMs är patch clamp inspelningar, som tillåter en mycket detaljerad analys av olika AP egenskaper och möjliggör även mätning enda ion kanal strömmar. Absoluta värden (t.ex., den vilande membranpotentialen) kan dessutom mätas. Däremot är optiska AP inspelningar baserat på relativa förändringar av membranpotentialen. På grund av den relativt långsamma inneboende kineticsen av VSFP, vissa AP egenskaper, såsom det ”överskridandet”, kan vara trubbiga från avläsningarna och en meningsfull kvantitering av snabb funktioner, såsom AP upstroke hastigheten, är inte möjligt. Dock i en typisk experimental set-up, inte de absoluta värdena, men skillnader i värden (t.ex., mellan olika cellinjer eller före och efter tillämpningen av en drog) mäts. Detta på ett tillförlitligt sätt kan uppnås med den optiska metod som beskrivs i detta manuskript för egenskaper som AP varaktighet (t.ex., APD90 eller APD50) eller slå takt, med en mycket högre dataflöde jämfört med patch clamp10 . Dessutom tillåter icke-invasiva arten av denna teknik flera mätningar av samma cell över tiden10. Optiska AP inspelningar och patch clamp bör således betraktas som kompletterande verktyg och används beroende på den experimentella fråga som behöver besvaras.
Optiska AP inspelningar kan uppnås antingen genom uttrycket av ett GEVI eller genom tillämpning av en potentiometrisk fluorescerande färgämne (t.ex., di-8-ANEPPs)21. De fluorescerande färgerna har oftast mer gynnsam fluorescens kinetik men kan inte riktas till en viss subtyp av hjärtmuskelceller som de inte är genetiskt-kodade. Ett antal GEVIs baserat på olika funktionsprinciper varit utvecklade22. Här används bandet-baserade GEVI VSFP-CR11 . Den största anledningen till detta val var proportionerlig natur denna indikator, som reagerar till cellulära depolarisation med en ökning i rött och en minskning i grön fluorescens om grönt fluorescerande protein är upphetsad. Detta är fördelaktigt inom kardiologi eftersom sådan en proportionerlig indikator är mindre känsliga för artefakter som orsakas av cell rörelser på grund av sammandragningar av hjärtmuskelcellerna än indikatorer som reagerar på depolarisering endast genom en förändring av deras fluorescensintensiteten.
Medan endast resultat från experiment inriktning ventrikulära-liknande iPSC-CMs använder den MLC2v förstärkare presenteras här, är det också möjligt att rikta förmaks - eller nodal-liknande CMs som använder olika subtyp-specifika promotorn elements10. För att beskriva metoden i detalj, Detta manuskript fokuserade på imaging enda iPSC-CMs som har varit seedade på ett täckglas, eftersom detta möjliggör analys av AP egenskaperna för enstaka celler och ger det högsta signal-brus-förhållandet. Denna teknik kan emellertid också av imaging av CMs som är integrerade med andra celler i en elektrisk syncytium eller en 3D-struktur. Detta är av särskilt intresse eftersom 3D-cell kultur modeller används alltmer och har visat sig ge egenskaper skiljer sig från 2-D modeller20. Beroende på imaging set-up och definitionen av ROIs, kan optiska signaler analyseras från större områden av 3D-vävnad eller från enstaka celler i vävnaden. Dessutom flera celler kan avbildas samtidigt och analyseras separat, vilket leder till en betydande ökning av genomströmning.
Sammantaget kan metoden presenteras här förbättra tillämpligheten av iPSC-CMs i arytmi forskningsområdet genom att aktivera den snabba optiska fenotypning av iPSC-CMs för arytmi-relaterade fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från den tyska forskningsfondens (Si 1747/1-1), den annan Kröner-Fresenius-Stiftung och Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
- Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research. Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).
- Rocchetti, M., et al. Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).
- Sinnecker, D., et al. Modeling long-QT syndromes with iPS cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).
- Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art. Life Sciences. , 98-113 (2016).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Den Hartogh, S. C., Passier, R. Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity. Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).
- Schweizer, P. A., et al. Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229 (2017).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Chen, Z., et al. Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes. European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2008).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).
- Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scientific Reports. 7, 5464 (2017).
- Dorn, T., et al. Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity. Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).
- Kaestner, L., et al. Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).
