Summary
כאן אנו מציגים שיטה אופטית התמונה פוטנציאל פעולה, במיוחד cardiomyocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה דמוי חדרית. השיטה מבוססת על הביטוי מונחה המקדם של חלבון פלואורסצנטי רגיש מתח.
Abstract
Cardiomyocytes שנוצר מתאי גזע pluripotent המושרה אנושי (iPSC-CMs) הינם כלי המתעוררים במחקר לב וכלי דם. במקום להיות אוכלוסיה הומוגנית של תאים, iPSC-CMs שנוצרו על-ידי פרוטוקולים בידול הנוכחית מייצגת תערובת של תאים עם חדרית-, פרפור-, ו פנוטיפים דמוי קטרי, אשר מסבך פנוטיפי ניתוחים. כאן, מוצגת שיטה אופטית שיא פוטנציאל פעולה במיוחד מ חדרית דמוי iPSC-CMs. זו מושגת על ידי התמרה חושית lentiviral עם מבנה שבו הוא מחוון בקידוד גנטית מתח תחת השליטה של רכיב ספציפי חדרית יזם. כאשר iPSC-CMs הינם transduced עם המבנה הזה, חיישן מתח מתבטא אך ורק בתאים דמויי חדרית, המאפשר הקלטות פוטנציאל ממברנה אופטי תת-סוג ספציפי באמצעות מיקרוסקופ זריחה זמן לשגות.
Introduction
Cardiomyocytes (CMs) שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) הינם כלי המתעוררים לנתח את המנגנונים המולקולריים של מחלת לב, לחקור, טיפולים, למסך1,תופעות לוואי לב2 ,3. כבר מן ההתחלה, מחלות arrhythmogenic כמו channelopathies היה מוקד חשוב של אזור זה מחקר4. כתוצאה מכך, שיטות לחקור פנוטיפים חשמלי של מערכת ניהול תוכן, כגון הפרעות בקצב הלב או שינויי פוטנציאל הפעולה (AP) מורפולוגיות, הן בלב של טכנולוגיה זו.
שיקול חשוב ביישום של iPSC-CMs היא כי הפרוטוקולים בידול הלב הנוכחי התוצאה אינה אוכלוסיה הומוגנית של תאים. במקום זאת, הם אינם אלא תערובת של תאים דמוי צומת סינוס, פרוזדורים, CMs חדרית ברמות שונות של ההבשלה5,6,7,8. הטרוגניות זו יכולים להיות מקור רלוונטי ההשתנות ניסיוני, במיוחד אם פרמטרים כגון משך AP (APD) נחקרות, אשר ממהותם שונים בין תת ס מ (למשלAPD היא קצרה ב פרפור מאשר ב- CMs חדרית). הגישה המקובלת כדי לטפל בבעיה זו היא לחקור יחיד iPSC-CMs בשיטת מלחציים תיקון כדי לסווג כל תא כמו קטרי-, פרפור-, או דמוי חדרית, המבוססת על מורפולוגיה שלה AP9. כל ניתוח מאוחר יותר יכולה להיות מוגבלת ואז על התאים המייצג את סוג המשנה של ס מ של ריבית. החיסרון העיקרי של האסטרטגיה הזו היא שלה תפוקה מוגבלת וחוסר יכולת הרחבה. יתר על כן, העיקרון החודרני של תיקון קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה אינו מאפשר את ההדמיה של אותם תאים ברצף במשך פרקי זמן ארוכים.
כאן, אנו מספקים פרטים ניסיוני שיטת10 שפותחו כדי שטיחות תמונה APs תתי סוגים ספציפיים של iPSC-CMs. זה מתגבר על הבעיה של סוג של הטרוגניות, מגדיל באופן דרמטי את התפוקה לעומת שיטות קונבנציונליות, ומאפשר את phenotyping המהירה של iPSC-CMs נושא וריאציות גנטיות או כסוכנים חשופים תרופתי.
סקירה של הגישה דימות אופטי תת-סוג ספציפי
מחוון בקידוד גנטית מתח (GEVI), אשר המאפיינים פלורסצנטיות לשנות דפולריזציה ועל רה-פולריזציה של קרום התא, משמש לשיקוף שטיחות שינויים בפוטנציאל הממברנה של CMs. GEVI להחיל כאן הוא החלבון הניאון חישה מתח VSFP-CR11, אשר מורכב של מתח חישה transmembrane תחום דבוקה זוג ירוקה (תלתן), חלבון פלואורסצנטי אדום (mRuby2) (איור 1 א'). בשל קרבתה של fluorophores שני, עירור של חלבון פלואורסצנטי ירוק תוצאות שבריר האנרגיה עירור מועבר את חלבון פלואורסצנטי אדום דרך העברת האנרגיה של תהודה פורסטר (סריג). לכן, עירור של חלבון פלואורסצנטי ירוק התוצאה פליטה הירוק והן את החלבונים ניאון אדום (איור 1A, החלונית העליונה). כאשר התא depolarizes, מבניים סידורם מחדש של החיישן מתח מתרחשת שמתרגמת ולהתפכחות שני חלבונים פלורסנט, תוך הגדלת היעילות סריג. לפיכך, אפילו יותר של האנרגיה עירור מועבר מן הירוק החלבון הניאון אדום (איור 1A, החלונית התחתונה). כתוצאה מכך, בתא depolarized, פליטת קרינה פלואורסצנטית ירוק מעומעמת, הפליטה פלואורסצנטי אדום בהיר יותר בתא כלא נח קרומית אפשרית (איור 1B).
איור 1: דימות אופטי של קרומית אפשרית עם VSFP-CR. (א) A מפרטים טכניים המתארים את הפעולה של החלבון הניאון מתח רגיש VSFP-CR מוצג. על דפולריזציה של קרום התא, מבניים סידורם מחדש בתחום transmembrane חישה מתח מיתרגם ולהתפכחות של ירוק (GFP) ו אדום חלבון פלואורסצנטי (RFP), הגדלת היעילות של פורסטר התפלגות העברת אנרגיה תהודה (סריג). (B) פליטת ספקטרום של VSFP על עירור של ה-GFP בתאים כמה פוטנציאל ממברנה המנוחה (החלונית העליונה), תאים depolarized (החלונית התחתונה) מתוארים. השינוי ספקטרלי על דפולריזציה היא מוגזמת עבור בהירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
השינויים היעילות סריג שיקוף של התנודות של קרום פוטנציאליים הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד עם מפצל תמונה, אשר מפריד בין פליטת קרינה פלואורסצנטית אדום וירוק, פרויקטים אותם על גבי שני תחומי סמוכים השבב של מצלמת sCMOS (איור 2). עם הגדרת הזה, פליטת קרינה פלואורסצנטית-שתי להקות גל שונים ניתן לרשום בו זמנית, המאפשר חישוב יחס של קרינה פלואורסצנטית אדום-כדי-ירוק כדי לשקף קרום פוטנציאל כל תמונה של סידרת זמן לשגות.
איור 2: קביעת תצורה של מערכת ההדמייה. המרכיבים העיקריים של מערכת ההדמייה נהגו התמונה מתוארים השינויים ספקטרלי של החלבון הניאון מתח רגיש שיקוף השינויים פוטנציאל ממברנה ברזולוציה הטמפורלית גבוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
הביטוי של VSFP-CR ב- CMs מושגת על ידי התמרה חושית lentiviral. ישיר ביטוי המשנה ס מ של עניין, lentivirus מכיל רכיב יזם (משפר MLC2v ) שמניע במיוחד שעתוק חדרית דמוי iPSC-CMs10. כאשר iPSC-CMs המייצגים תערובת של תאים כמו פרפור דמוי קטרי, דמוי-חדרית הן transduced עם lentivirus הזה, VSFP-CR מבוטאת רק בתאים דמויי חדרית. מאז ההדמיה פוטנציאל הפעולה אופטי תלוי חיישן פלורסנט, פוטנציאל הפעולה המוקלטת לייצג באופן בלעדי המשנה ס"מ עניין (איור 3).
איור 3: ביטוי VSFP מונחה יזם עבור הדמיה פוטנציאל ממברנה סוג ספציפי. () הסכמות מציגה איך ניתן להשיג cardiomyocyte ספציפית סוג של פוטנציאל הפעולה אופטי הקלטות. iPSC (b)-נגוע VSFP תחת השליטה של MLC2v-משפר חדרית ספציפיים CMs מוצגים. הביטוי של החיישן מתח הוא ציין רק ב- CMs חדרית כמו בערוץ ה-GFP (החלונית הימנית). שלב ניגודיות (לוח האמצעי) ואת שכבת-על התמונה (לוח נכון) הינם גם מסופקים. הקווים המנוקדים לבן לסמן גבולות התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת Cardiomyocytes נגזר iPSC עבור הדמיה
הערה: שיטות התמיינות והתרבות הלב iPSC פורסמו לפני12,13,14 , לא דנו כאן בפירוט. הטיהור של iPSC-CMs על-ידי בחירה לקטאט microdissection ידנית, ההפרדה תא מגנטי או מומלץ, בהתאם פרוטוקול בידול שמשמש. עבור פרוטוקול הבאים, microdissected explants להכות באזורים, שנוצר באמצעות פרוטוקול של בידול חד שכבתי13, היו נלקחה ביום 15 של הבחנה לב ותרבותית עד יום 30 על צלחות מצופה fibronectin כמתואר לפני10.
- לקחת התא תרבות צלחות מתוך החממה ולאסוף באופן ידני את explants הלב לתוך צינורות microcentrifuge באמצעות פיפטה 200 µL. לאחר שקיעת, תשאף התרבות תא supernatant ולשטוף בעדינות את explants 2 x עם האנק הוא מאוזן מלח פתרון (HBSS).
- מביצועם iPSC-CMs על-ידי הוספת collagenase מסוג II (430 U/mL ב HBSS) דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לאחר שיקוע של התא גדול הנותרים מתגבש, לאסוף את תגובת שיקוע המכיל את dissociated יחיד iPSC-CMs, להוסיף את זה לרשימת טרי בינוני תחזוקה ס"מ המכילה ריכוז גבוהה סרום שור עוברית (FBS) (DMEM-F12, 20% FBS, 2 מ מ L-glutamine, חומצות אמינו מטריים MEM שאינם חיוניים, פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין ו- 0.1 מ"מ β-mercaptoethanol).
- חזור על הדיסוציאציה של אם נותרים גושים תא גדול. IPSC-CMs לאסוף על ידי צנטריפוגה וגם resuspend אותם במדיום ס"מ המכילה ריכוז FBS נמוך (2% FBS).
- מחדש זרע יחיד iPSC-CMs ב צפיפות ומאפשר ההדמיה עוקבות של תאים בודדים על 3.5 ס"מ זכוכית-התחתון תא תרבות microdish זה יש כבר מצופה fibronectin (2 µg/cm2). למטב את צפיפות זריעה לפני העוסקים בניסויים תפוקה גבוהה. בדרך כלל, 5 – 10 explants לב לכל מאכל 3.5 ס"מ מספיקים; עם זאת, זה בכבדות תלוי בגודל explant ואת טוהר.
- תרבות של יחיד iPSC-CMs לאחר שלהם דיסוציאציה ס מ תחזוקה בינוני המכיל 2% FBS לפחות 48 שעות על מנת להבטיח החלמה מספיקות.
הערה: בשלבים הבאים, iPSC-CMs הינם transduced עם lentivirus קידוד של GEVI VSFP-CR תחת השליטה של שיפור MLC2v 10 כדי להשיג ביטוי GEVI חדרית ספציפיים. לחלופין, בונה lentiviral המאפשר לבטא את GEVI באופן ספציפי בתאים קטרי פרפור דמויי, או לבנות לא ספציפי מסתירים את מקדם PGK הביע ubiquitously, יכול להיות בשימוש10. פלסמידים lentiviral הינם זמינים על פי בקשה.
התראה: בעת עבודה עם חלקיקים lentiviral, ודא כי סביבת העבודה יש רמת אבטחה נאותים, לדבוק בהוראות הבטיחות לעבודה עם פוטנציאל מדבקים, וקח הבטיחות הנדרשות. - הכן המדיום זיהום על ידי ערבוב lentivirus10-המכיל תרבית תאים supernatant, אשר כבר מיוצר בתאים HEK293 כמתואר לפני15, CMs תחזוקה בינונית (ראה שלב 1.3) ביחס 1:1.
- להוסיף hexadimethrine ברומיד ריכוז הסופי של µg/mL 8 כדי לשפר את היעילות זיהום.
הערה: עקב הזיהום גבוהה היעילות של ריכוז lentivirus דרך ultracentrifugation מוקדמת iPSC-CMs נחוצה בדרך כלל לא. - תשאף המדיום תחזוקה ס מ מ יחיד iPSC-CMs ולהחליף אותו עם המדיום זיהום שהוכנו במהלך שלבים 1.7 ו- 1.8. תרבות של נגוע יחיד iPSC-CMs במדיום זיהום במשך 12 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, תשאף המדיום ולהחליף אותו שוב עם ס מ תחזוקה בינוני.
הערה: אות פלורסצנטיות מתוך GEVI מופיעה 48 שעות לאחר ההדבקה. לדימות של ההקלטות פוטנציאל ממברנה מומלץ, 72 h לאחר ההדבקה לכל המוקדם, על מנת להבטיח חוזק האות הנכונה. IPSC נגוע יחיד-CMs יכול להיות תרבותי למשך לפחות 3 שבועות, עם תמונה ברצף. אם photobleaching נרחב מתרחשת במהלך מפגש הדמיה, האות פלורסצנטיות משחזרת לאורך זמן. - לפני הדמיה, להחליף המדיום התרבות התא על-ידי הפתרון של Tyrode בתוספת Ca2 + (135 מ"מ NaCl, 5.4 מ"מ אשלגן כלורי, MgCl 1 מ2, גלוקוז 10 מ מ, מ מ 1.8 CaCl2ו 10 מ מ HEPES; pH 7.35).
2. הקלטות פוטנציאל ממברנה אופטי
- המקום תא הדמיה המכיל את iPSC-CMs על הבמה של מיקרוסקופ epifluorescence הפוכה מצויד עם הפיצול של התמונה, את מערכות הסינון המתאימה של מצלמה (למשל, מצלמה sCMOS) המסוגל הדמיה במהירות גבוהה גבוהה רגישות.
הערה: לדוגמה, שימוש 480/40 ננומטר הלהקה לעבור עירור לסנן בשילוב עם 500 ננומטר פס ארוך מראה ודיקרואיק זוהר במיקרוסקופ, 568 nm פס ארוך מראה ודיקרואיק זוהר בשילוב עם 520/28 nm ו 630/75 ננומטר הלהקה לעבור מסננים פליטה של המפצל התמונה. לדימות תא יחיד, מספק מטרה טבילה שמן גבוהה-הגדלה, גבוה-מספרית-צמצם את יחס אות לרעש הטוב ביותר. - אם צועד חשמלי נדרש, להתקין אלקטרודות להתהלך בבית הבליעה הדמיה וחבר אותן לגנרטור הגירוי.
הערה: השתמשנו שיבוץ pacing זה הכיל שתי אלקטרודות הפלטינה ולהכניסם לתוך הכלים תרבות 3.5 ס"מ תא זכוכית-התחתון. התאים ממוקם בין האלקטרודות היו עם תמונה. פרמטרים צועד טיפוסי הם פולסים מלבניים של 5 מילי-שניות משך, עם משרעת של 10 V/cm אלקטרודה מרחק. - באופן אופציונלי, להשתמש במה מיקרוסקופ מחוממת כדי להבטיח לטמפרטורה יציבה של iPSC-CMs במהלך דימות, או אפילו במיקרוסקופ הדגירה קאמרית מלכודת אם דימות לטווח הארוך מיועד.
- להביא את התאים להתמקד ולמקם תא לבטא את GEVI למרכז השדה הצפייה.
הערה: זה באופן נוח ביותר נעשה על ידי שימוש של עיניות של המיקרוסקופ באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או אדום חלבון פלואורסצנטי (RFP) מסנן מוגדר לזהות תאים לבטא את GEVI. - להגדיר את הנתיב אופטי כך האור הנפלט מנותבת המפצל התמונה. לעבור את הקוביה מסנן במיקרוסקופ אחד כדי להיות משולב עם המסננים בתפריט המפצל תמונה (ראה טבלה של חומרים).
- בתוכנה שליטה על המצלמה, להגדיר את ההגדרות רכישה כך הדמיה במהירות גבוהה (למשל, 100 מסגרות לשנייה, עם זמן חשיפה של 10 ms לכל מסגרת) אפשרית.
הערה: בדרך כלל, זה כולל את binning של המצלמה פיקסלים (למשל, 8x 8 פיקסלים של השבב המצלמה נמצאים מנופה ליצור פיקסל אחד בסרט בצילום מואץ). - להגדיר את המפצל התמונה על פי הוראות היצרן. שתי תמונות המייצגים שתי הלהקות גל פליטה שונים צריך להיות סמוכים זה לזה, כל כובש אחד חצי של התמונה.
הערה: שלב זה חייב להיות המבוצעת רק 1 x בתחילת כל מפגש הדמיה. - בדוק, במידת הצורך, התאם את המוקד של התמונה המיוצר על ידי המצלמה.
- כוונן את הבהירות של האור תאורה כך כל הרוויה של הפיקסלים הוא נמנע; זה יכול בקלות הרבה ביותר להיעשות באמצעות לוח צבעים שבו פיקסלים רווי מיוצגים על-ידי צבע ייחודי.
הערה: במהלך כל ההכנות האלה לפני הדמיה, להגביל את החשיפה של המדגם עירור אור הסכום הדרוש (קרי, ולא משאירה האור דולק עבור המורחבת פרקי זמן) כדי למנוע photobleaching של GEVI. - להגדיר את רכישת סדרת הזמן (לדוגמה, 5,000 תמונות ב- 100 מסגרות לשנייה עבור משך סדרה של 50 s). עמעם את האור בחדר (כולל צגי מחשב) כדי למנוע כניסת אור המשפיעים על המדד. אם תריס אור עירור היא לא נשלטת על ידי תוכנת הדמיה לפתוח אותה רק לפני תחילת הרכישה.
- התחל רכישת סדרת תמונות. אם צועד חשמל רצוי, להתחיל את הרצף pacing בנקודת זמן מתאים, אלא אם כן זה מאותחלת באופן אוטומטי על ידי תוכנת הדמיה. אם היישום של סוכן תרופתי הוא מבוקש, ועושה את זה באופן ידני (לדוגמה, על-ידי pipetting 100 µL של הסוכן ב ריכוז סוף tenfold לחדר ההקלטה המכיל 900 µL של המאגר, בעדינות לערבב אותו עם פיפטה) או באמצעות מערכת תזרים קבוע זלוף.
- עם סיום הרכישה, סגור את התריס אור עירור במידת הצורך. לשמור את ההקלטה הכונן הקשיח.
- עוזב את הגדרות הקלטה (דהיינו, זמן החשיפה, קצב מסגרות, עוצמת האור) ללא שינוי, לבצע הקלטה של זריחה רקע (כמו שלב 2.11) אזור coverslip אשר אינו מכיל תאים או coverslip אחר שעליו לא יש כבר נזרע תאים.
הערה: אם מדידות רציפות נעשות מבלי לשנות את ההגדרות רכישה, רק רקע זריחה הקלטה אחת הכרחי עבור כל המידות הללו. - אם רצונך בכך, לבצע ניסויים נוספים (שלבים 2.4-2.13) שונה iPSC-CMs ממוקם על coverslip זהה. להיות מודע כי כל CMs על coverslip יושפעו למקרה סם היה מוחל.
3. ניתוח
> הערה: סומך על תוכנת הדמיה להשתמש (שהוא בדרך כלל חבילת תוכנה קניינית המסופקים על ידי היצרן של המצלמה או של זריחה כל מערכת הדמיה), ייתכן שתהיה אפשרות לבצע הניתוח של הדימויים רכשה חלקית, או אפילו לחלוטין בתוך חבילת התוכנה. עם זאת, כאן זרימת עבודה של ניתוח תמונה שניתן לבצע עם תוכנת קוד-פתוח (קרי, פלטפורמת ניתוח התמונה ImageJ)16, אשר יכול להיות נוח מותקן באמצעות הפצה כגון פיג'י17ו- R אריזה חישוב סטטיסטי18 מתוארים. בקצרה, אזורים מעניינים (ROIs) המייצג תאים או רקע נמשכים ב ImageJ, קרינה פלואורסצנטית רשע ב ROIs אלה לאורך זמן מיוצא לקובץ שינותח, לאחר מכן, בהמשך ב- R או, לחילופין, עם תוכנת הגיליון האלקטרוני.
- בתוכנת הדמיה, לשמור או לייצא סדרת הזמן התמונה נרכשת (את ההקלטה המכילות את התאים והן את ההקלטה הרקע המתאים) לתבנית (למשל, TIF) שניתן לקריאה על-ידי ImageJ. לחלופין, להשתמש תוסף BioFormats (https://imagej.net/Bio-Formats), אשר מספק רוטינות הפעלת ImageJ לקרוא תבניות קובץ קניינית של מותגים שונים של יצרני מערכת הדמיה.
הערה: השלבים הבאים להניח כי המרווחים הדמיה זהים במהלך ההקלטה. אם זה לא המקרה, ייתכן צורך לייבא את המידע תזמון בתוכנת הדמיה ולכלול אותו בניתוח נוסף. - פתח את הערימה TIF המכיל תאי ImageJ.
- השתמש בכלי בחירה ביד חופשית כדי לצייר רועי מעל cardiomyocyte פלורסנט בערוץ אדום. ודא כי ההחזר הוא גדול מספיק כך התא לא זזה מתוך רועי תוך כיווץ.
- פתח את התוסף מנהל רועי ('נתח | כלים | רועי מנהל ') ולחץ על לחצן 'הוספה [t]' כדי להוסיף את זה רועי ROI1.
- גררו את רועי באותו התא בערוץ ירוק ולהוסיף את רועי כמו ROI2.
- ב- ' לנתח | לקבוע מידות תפריט, בטל את בחירת כל האפשרויות חוץ "מתכוון ערך האפור".
הערה: זה צריך להיעשות רק 1 x בהפעלה ImageJ. - במנהל רועי, הקש את ' יותר | ריבוי אמצעי ' לחצן. בחר באפשרויות 'למדוד את כל הפרוסות' ו- 'שורה אחת לכל פרוסה' ולחץ על 'אישור'. נפתח חלון המכיל גיליון אלקטרוני עם שלוש שורות (המספר פרוסה ו של זריחה רשע ב ROIs שני המייצגים התא האדום בערוץ ירוק, בהתאמה).
- השתמש ' קובץ | שמירה בשם כדי להציל את הגיליון האלקטרוני לתוך קובץ ערך מופרד באמצעות פסיק (CSV).
- סגור את החלון עם אוסף התמונות והחלון של גיליון אלקטרוני מבלי לסגור את החלון מנהל רועי. פתח את הערימה TIF המכיל את המדידה רקע.
- במנהל רועי, הקש את ' יותר | ריבוי אמצעי' לחצן. בחר באפשרויות 'למדוד את כל הפרוסות' ו- 'שורה אחת לכל פרוסה' ולחץ על 'אישור'.
- השתמש ' קובץ | שמירה בשם לשמור את הגיליון האלקטרוני עם נתוני רקע לתוך קובץ CSV אחר.
הערה: ניתן לעשות את החישובים הבאים עם תוכנת הגיליון האלקטרוני. השתמשנו בתוכנה R18. תסריט דוגמא פשוטה שקוראת הנתונים תא ורקע מן הקבצים "cell.csv" ו "background.csv" מבצעת את החישובים, מתווה מסלול הזמן של האות פוטנציאל ממברנה מסופק 1 קובץ קוד משלים. - מן ההקלטה רקע, לחשב את העוצמה הממוצעת באדום, לערוץ הצבע הירוק. להחסיר הזה רקע האיתות האותות המייצג את התא בערוץ אדום וירוק לחישוב מתוקן-רקע RFP, אותות ה-GFP, בהתאמה.
- בתור פונדקאית עבור קרום פוטנציאליים, לחשב את יחס ה/RFP-GFP.
הערה: היחס הזה הוא שהוא. לחלופין, זה יכולה להיות מנורמל לערך ההתחלתי שלו (כלומר, ΔR/R0). חשוב לציין, מידע שימושי נכלל השינויים הטמפורלי, במקום את הערכים המוחלטים של היחס הזה. עקב photobleaching לא אחידה של ה-GFP, RFP, הסחף בסיסית יחס זה עלול להתרחש. במידת הצורך, כזה להיסחף בסיסית עשויה להיפתר על-ידי בניית עקומת בסיסית ולאחר הפחתה זה של יחס ה/RFP-GFP10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ב- איור 4a, מתואר נציג יחיד iPSC ס מ עם הקווים המנוקדים לבן סימון רועי במהלך הניתוח ההדמיה ב- RFP (בצד שמאל) וערוץ GFP (צד ימין). האות מערוץ RFP מציג עלייה תקופתיים פלורסנט בעוצמה במהלך כל פוטנציאל הפעולה (איור 4b, החלונית העליונה). כפי שתואר במבוא, זאת בשל סריג הגוברת עקב שינויים קרום פוטנציאליים (איור 1). אולי תבין, האות ה-GFP מראה ירידה תקופתית בעוצמתם פלורסנט (איור 4b, בחלונית האמצעית). היחס RFP/GFP (איור 4b, החלונית התחתונה) היא האות הביולוגיים בשימוש ניתוחים במורד הזרם, כגון APD50 ומדידות90 APD. באמצעות שיטה זו, בת שלושים יום חדרית דמוי iPSC-CMs בקצב ב 0.5 הרץ הראה ממוצע APD50 (פרק הזמן מתחילת פוטנציאל הפעולה עד רה-פולריזציה הושלמה ב-50%) של ms 439 (± 46 ms), ממוצע APD90 (משך עד רה-פולריזציה הושלמה על ידי 90%) של ms 520 (± 47 ms) (איור 4 c).
איור 4: עקרונות של ניתוח תמונה ומאפיינים בסיסיים פוטנציאל הפעולה. () RFP מוקלט בו זמנית (צד ימין) מוצג GFP (בצד שמאל) זריחה iPSC יחיד-ס מ. הקווים המנוקדים לבן מייצגים את האזורים של הריבית (ROI) המשמש לניתוח הדמיה. (b), גלם, עקבות של הרקע-מתוקן RFP, ה-GFP, ומוצגים אותות ה/RFP-GFP נגזר רועי. (ג) האמצעים ואת SEM של APD90 ואת APD50 של יחיד דמוי חדרית iPSC-CMs בטמפרטורת החדר, עם 0.5-הרץ צועד מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
כדי להדגים כי השיטה היא גם מסוגלת ללכוד שינויים משך פוטנציאל הפעולה, iPSC-CMs היו מגורה חשמלית בהגברת גירוי המחירים החל 0.4 Hz 2.5, הגברת הקצב של כל חמש פעימות (איור 5). אות פוטנציאל ממברנה מוקלטת שטיחות טיפוסי מתוך iPSC אחד-ס"מ מוצג באיור 5a. פוטנציאל פעולה ארבע הראשונות בקצב כל המכות היו בממוצע, להפגין לקיצור פרוגרסיבי של פוטנציאל פעולה בקצב מוגבר מכות (איור 5b). ממוצע של פעימות בקצב עוקבות היא שיטה יעילה להפחתת הרעש הטמון מוקלטת שטיחות פוטנציאל פעולה10. יצוין, כי הניסוי מתוארים יכול ללכוד את הסכום המלא של פוטנציאל הפעולה תלויי-שיעור קיצור אפשרי, בהתחשב בעובדה שאנחנו בקצב התא עבור רק חמש פעימות בקצב כל pacing, אשר אולי לא יספיק להגיע שיווי משקל.
איור 5: השפעת תדירות pacing על משך פוטנציאל הפעולה. () IPSC-ס"מ היה בקצב בהגברת תדרים הנע בין 0.4 ל 2.5 Hz כמצוין (הפולסים pacing חשמלי יחיד מיוצגים על-ידי חצים). (b) עבור כל תדר pacing, AP בממוצע היה שמחושבים על גישה ארבע הראשונות בתדר הזה. גישה בממוצע מותוות ככיסוי, הממחיש את AP קיצור עם הגדלת שיעורי צועד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
השיטה יכולה לשמש גם כדי לחקור אלקטרופיזיולוגיות השפעות הסמים שהוחל iPSC-CMs (איור 6). כאן, isoproterenol, אגוניסט β-adrenoreceptor לא בררניים, הופעלה באופן ספונטני-מכות iPSC-CMs כמצוין, שמוביל עלייה מהיר קצב פעימות (איור 6a). עקומת מנה-תגובה שמראה את השפעת ריכוזים שונים של Isoproterenol בתדר הפועם של iPSC-CMs מוצג באיור 6b.
איור 6: השפעת isoproterenol על התדר מכות. () העקיבה מייצג פוטנציאל הפעולה raw אופטי של מכות באופן ספונטני iPSC-ס מ אחד מוצג. Isoproterenol (עם ריכוז סופי של 1 מיקרומטר) נוספה iPSC-CMs כמצוין ליד הבר. (b) עקומת מנה-תגובה זו מראה את השפעת ריכוזים שונים isoproterenol בתדר הפועם של iPSC-קווי שגיאה CMs. לייצג סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן מאפשר הקלטת אופטי של APs מ תת סוג מסוים (כלומר, תאים דמויי חדרית) של CMs המופקים iPSCs האנושית. IPSC אנושי-CMs הינם כלי המתעוררים כדי לטפל במגוון עצום של בעיות ביולוגי ורפואי, הבידול כדי תתי סוגים שונים של ס מ הוא מקור חשוב של השתנות ניסיוני. באמצעות אלמנטים ספציפיים יזם, הביטוי של GEVI מושגת במיוחד ב- CMs המייצג את סוג המשנה של הריבית, אשר לאחר מכן עם תמונה אופטית.
רכישה מוצלחת של APs מ iPSC יחיד-CMs תלוי צפיפות reseeding לאחר הדיסוציאציה. אם התאים נמצאים reseeded צפוף מדי, זה זמן רב כדי למצוא מבודד יחיד iPSC-CMs שאינם חלק syncytium חשמל. עם זאת, צפיפות נמוכה גם זריעה להשפיע לרעה על ההישרדות של התאים. לכן, בדיקה שיטתית של צפיפויות שונות זריעה מומלץ, בייחוד לפני העוסקים בניסויים התלויות הדמיה תפוקה גבוהה.
במהלך רכישת התמונה, עובר VSFP photobleaching, אשר עלול להשפיע לרעה על יחס אות לרעש, במיוחד במהלך ניסויים זמן רב יותר. אם photobleaching מהירה במהלך הניסוי, נא ודא כי עירור תריס אור רק נפתח במהלך רכישת התמונה או במהלך השלבים הדרושים הכנה (חיפוש, התמקדות לבטא VSFP תאים), שאמור להיות לבצע מהר ככל האפשר. בנוסף, לצמצם את כוחו של עירור אור עד לסכום מינימלי הדרוש ולעשות שימוש הטווח הדינמי של המצלמה רגישות גבוהה בשימוש עבור רכישת התמונה.
כאשר הציור רועי במהלך הניתוח תמונה, להיות מודע לכך iPSC-CMs יזוזו בשעת ההתכווצות צריך להישאר בתוך רועי כל תמונות של אוסף התמונות. בשל אופיו רציומטרי של VSFP, כל תנועה של התא. רועי לא להוביל אותות מלאכותיים אך עלול להשפיע לרעה על איכות האות. עם זאת, ROIs גדולים מדי, כוללים שטחים גדולים שלא לצורך-מפיק אות להשפיע לרעה גם להשפיע על יחס אות לרעש, יש להימנע.
לקבלת תוצאות נציג, הבדיל iPSC-CMs זה מותר להתבגר למשך 30 ימים לפחות לאחר אינדוקציה הלב השתמשו. אחרי תקופת ההבשלה, ס מ שונים תת, כגון קטרי-, פרפור-, או תאים דמויי חדרית ניתן להבחין. תאים אלה הן ילדותי עדיין ולהגיע רק של פנוטיפ עובריים כמו במערכות תרבות דו-ממדית (2-D) המשפיעים על תכונות חשמליות וכן סידן טיפול19. אלה מגבלות כללי של iPSC-CMs צריך להיחשב, כאשר הם עשויים לבלבל את תוצאות ניסויית עצמאית של השיטה למדידת פוטנציאל פעולה. מערכות מתקדמות תלת מימדי התרבות (תלת-ממדי) הראו תוצאות מבטיחות לקראת התבגרות נוספת20, השיטה המתוארת כאן יכול להיות בעל ערך בהקשר זה.
תקן הזהב הנוכחי עבור APs מדידה של iPSC-CMs הקלטות מלחציים תיקון, אשר מאפשרים ניתוח מפורט מאוד של מאפיינים שונים של AP, אפילו מאפשר מדידת זרמים ערוץ יון בודד. בנוסף, ניתן למדוד ערכים מוחלטים (למשל, קרום מנוחתו פוטנציאליים). לעומת זאת, אופטי הקלטות AP מבוססים על שינויים יחסית של פוטנציאל הממברנה. עקב קינטיקה מהותי האיטי יחסית של VSFP, מאפייני AP מסוימים, כגון "להחטיא", עשוי להיות קהה מן המקראות, כימות משמעותי של תכונות מהר, כגון מהירות upstroke AP, אינה אפשרית. עם זאת, במלכודת ניסויית טיפוסית, לא את הערכים המוחלטים, אבל ההבדלים בערכים (למשל, בין שורות תאים שונים או לפני ואחרי היישום של תרופה) נמדדים. אפשר להשיג באופן אמין עם השיטה אופטי המתוארת בכתב היד עבור מאפיינים כמו משך AP (למשל, APD90 או APD50) או קצב המכות, עם תפוקה גבוהה יותר לעומת מלחציים תיקון10 . יתר על כן, הטבע לא פולשנית של טכנולוגיה זו מאפשרת מדידות מרובות באותו התא זמן10. לפיכך, אופטי הקלטות AP מלחציים תיקון צריך להיות נחשב כלים משלימים, בשימוש בהתאם השאלה ניסיוני שצריך לענות.
אופטי הקלטות AP יכולה להיות מושגת על-ידי הביטוי של GEVI או על-ידי היישום של הפלורסנט potentiometric (למשל, di-8-ANEPPs)21. צבעי פלורסנט קינטיקה פלורסצנטיות בדרך כלל נוחים יותר אבל לא יכולה להיות מופנית תת סוג מסוים של cardiomyocytes כפי שהם לא גנטית-מקודדים. מספר GEVIs מבוססת על עקרונות הפעלה שונות כבר מפותחת22. . הנה, מבוסס סריג GEVI VSFP-CR11 משמש. הסיבה העיקרית על בחירה זו היה האופי רציומטרי של מחוון זה, אשר מגיב דפולריזציה הסלולר עם עלייה אדום לבין ירידה ברמת קרינה פלואורסצנטית ירוק אם חלבון פלואורסצנטי ירוק הוא נרגש. זה יתרון בתחום קרדיולוגיה. בגלל כאלה מחוון רציומטרי הוא פחות רגישים חפצים הנגרמת על ידי תנועות התא עקב התכווצויות של cardiomyocytes מאשר למחווני מגיבים depolarization רק על ידי שינוי שלהם עוצמת קרינה פלואורסצנטית.
ואילו רק תוצאות של ניסויים מיקוד iPSC חדרית דמוי-באמצעות משפר את MLC2v CMs מוצגות כאן, זה גם אפשרי למקד פרפור קטרי דמויי CMs באמצעות אלמנטים שונים מקדם סוג ספציפי10. כדי לתאר את שיטת בפירוט, כתב יד זה התמקד הדמיה iPSC-CMs יחיד זה יש כבר נזרע על coverslip זכוכית, כמו זה מאפשר הניתוח של המאפיינים AP של תאים בודדים ומספק את יחס אות לרעש הגבוהה ביותר. עם זאת, טכנולוגיה זו מאפשרת גם ההדמיה של CMs המשולבות עם תאים אחרים של syncytium חשמל או מבנה תלת-ממדי. זהו עניין מיוחד כמו מודלים של תרבות תלת-ממדי תא משמשים יותר ויותר, הוכחו לספק מאפיינים שונים בדו-ממד מודלים20. בהתאם את ההדמיה קביעת ההגדרה של ROIs, ניתן לנתח אותות אופטי אזורים גדולים של הרקמה תלת-ממדי או תאים בודדים בתוך הרקמה. יתר על כן, תאים מרובים יכולים להיות בו זמנית עם תמונה וניתח בנפרד, שהוביל לעלייה בתפוקה.
יחדיו, השיטה המובאת כאן עשוי לשפר את הישימות של iPSC-CMs בתחום של הפרעות קצב מחקר על-ידי הפעלת את phenotyping אופטי מהיר של iPSC-CMs עבור פנוטיפים הקשורות להפרעה בקצב הלב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים קרן מחקר גרמני (סי 1747/1-1), Kröner-Fresenius-Stiftung אחר, את לדנציג Stiftung דויטשה Herzforschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
References
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
- Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research. Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).
- Rocchetti, M., et al. Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).
- Sinnecker, D., et al. Modeling long-QT syndromes with iPS cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).
- Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art. Life Sciences. , 98-113 (2016).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Den Hartogh, S. C., Passier, R. Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity. Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).
- Schweizer, P. A., et al. Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229 (2017).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Chen, Z., et al. Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes. European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2008).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).
- Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scientific Reports. 7, 5464 (2017).
- Dorn, T., et al. Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity. Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).
- Kaestner, L., et al. Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).
