Raumzeitlich kontrollierte nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit Käfig molekulare Leime als Photoactivatable Tags

Published: January 17, 2019

doi:

Rina Mogaki, Kou Okuro, Akio Arisaka, Takuzo Aida²

¹Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering,University of Tokyo, ²Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

Dieses Protokoll beschreibt Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit Käfig molekularen Klebstoff-Tags. Diese Methode ist viel versprechend für Website-selektiv-targeting Drug-Delivery.

Abstract

Der Zellkern ist eines der wichtigsten Organellen als subzelluläre Drug Delivery-Ziel seit Modulation der gen-Replikation und Ausdruck ist wirksam zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten. Hier zeigen wir, dass Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste mit molekularen Klebstoff (^CagedKleber-R) Tags, sperrte deren mehrere Guanidinium Ion (Gu⁺) Anhänger von einer anionischen Photocleavable Gruppe (Butyrat-substituierten geschützt sind Nitroveratryloxycarbonyl; ^BA SVOC). Gäste, die mit dem Stichwort ^CagedKleber-R sind berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose und bleiben in Endosomen. Allerdings wird auf Photoirradiation, ^CagedKleber-R in uncaged molekularen Klebstoff (^UncagedKleber-R) tragen mehrere Gu⁺Anhänger umgewandelt, die Endosomal entweichen und anschließenden nuklearen Translokation der Gäste erleichtert. Diese Methode ist vielversprechend für Website-selektiv-targeting Drug-Delivery, da tagged Gäste in das Zytoplasma, gefolgt von den Zellkern übergehen können nur dann, wenn Photoirradiated. ^{Im Käfig} Kleber-R Tags können makromolekularen Gäste wie Quantenpunkte (QDs) sowie kleine Molekül Gäste liefern. ^{Im Käfig} Kleber-R Tags sind uncaged mit nicht nur UV-Licht, sondern auch zwei-Photon Nah-Infrarot (NIR) Licht, das tief in das Gewebe eindringen kann.

Introduction

Der Zellkern, der genetischen Information trägt, ist eines der wichtigsten Organellen als subzelluläre Drug Delivery-Ziel seit Modulation der gen-Replikation und Ausdruck ist wirksam zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs und genetische ¹^,²^,³-Störungen. Für nukleare Lieferung von Medikamenten Konjugation von Peptid Stichwörter wie nukleare Lokalisierung Signale (NLS)⁴^,⁵^,⁶ allgemein untersucht worden ist. Um unerwünschte Nebenwirkungen zu reduzieren, ist jedoch räumlich-zeitliche Kontrolle der nuklearen Translokation notwendig.

Zuvor wurde Licht ausgelöst Translokation von Proteinen in den Zellkern mit Käfig NLS⁷^,⁸^,⁹erreicht. NLS wandert in den Zellkern durch die Bindung an zytoplasmatischen Transport Proteine⁶. In den gemeldeten Methoden sind Gast Proteine mit Käfig NLS direkt in das Zytoplasma durch Mikroinjektion⁸ integriert oder in den Zielzellen mit einem genetischen Code Ausbau Technik⁹ausgedrückt. Daher ist eine Methode, die zelluläre Aufnahme und Foto-induzierte nuklearen Translokation erreichen kann vorteilhaft für praktische Anwendungen.

Hier beschreiben wir Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit dendritischen eingesperrte molekularen Klebstoff (^CagedKleber-R, Abb. 1) Tags. Wasserlösliche Leime molekulare¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ mit mehreren Gu⁺ -Anhänger sind bereits entwickelt worden, die halten uns fest an Proteine¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶^,¹⁷, Nukleinsäuren¹⁸^,¹⁹^,²⁰, Phospholipid-Membranen-²¹und Ton Nanosheets²²^,²³ durch die Bildung von zahlreichen Salz Brücken zwischen ihren Gu⁺ -Anhänger und Oxyanionic Gruppen auf die Ziele. Die Gu⁺ -Anhänger ^CagedKleber-r sind durch einen anionischen Photocleavable Gruppe, Butyrat ersetzt Nitroveratryloxycarbonyl (^BASVOC) geschützt. Gäste, die mit dem Stichwort ^CagedKleber-R sind berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose und Aufenthalt in Endosomen (Abbildung 2). Auf Photoirradiation sind die ^BASVOC Gruppen von ^CagedKleber-R freistehend ein uncaged molekularen Klebstoff (^UncagedKleber-R) tragen mehrere Gu⁺ Anhänger nachzugeben, dann die Migration von tagged Gast erleichtert in das Zytoplasma, gefolgt von den Zellkern (Abbildung 2). ^Caged-Kleber-R-Tag kann durch die Einwirkung von UV- oder zwei-Photon Nah-Infrarot (NIR) Licht ohne schwere Phototoxizität uncaged. Wir demonstrieren die raumzeitlich kontrollierte nukleare Lieferung von makromolekularen Gäste sowie kleine Molekül Gäste mit ^CagedKleber-R Tags Quantenpunkte (QDs) mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Nitrobenzoxadiazole; NBD), bzw. als Beispiele.

Abbildung 1: Schematische Strukturen der ^CagedKleber-R. Die 9 Guanidinium Ion (Gu⁺) Anhänger ^CagedKleber-r sind von einer Gruppe von Butyrat ersetzt Nitroveratryloxycarbonyl (^BASVOC) geschützt. Die ^BA-SVOC-Gruppen sind durch Bestrahlung mit UV- oder zwei-Photon NIR Licht gespalten. Die fokale Kern ^CagedKleber-R ist mit Nitrobenzoxadiazole (NBD) oder Dibenzocylooctyne (DBCO) funktionalisiert. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-²⁰. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Licht-ausgelösten nuklearen Translokation Gäste konjugiert mit einem ^CagedKleber-R Tag. Der Gast /^CagedKleber-R Konjugat berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose. Auf Photoirradiation ist das ^CagedKleber-R Tag uncaged die Bezeichnung für einen ^Uncaged-Kleber-R, weichen, der Endosomal Entweichen von der tagged Gast erleichtern kann. Anschließend wandert der tagged Gast in den Zellkern. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-²⁰. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

1. Vorbereitung der Gäste mit KäfigKleber-R Stichwörter CagedKleber-NBD Lösung ansetzen. CagedKleber-NBD (Abbildung 1) nach dem Verfahren beschriebenen20zu synthetisieren. Bereiten Sie eine Stammlösung CagedKleber-NBD (10 mM) in trockenen Dimethyl Sulfoxid (DMSO).Hinweis: Bewahren Sie die Stammlösung in Dunkelheit. Die Lösung kann mit wässrigen Puffer oder Zellkulturmedien nach Gebrau…

Representative Results

Vor Photoirradiation, Hep3B Zellen inkubiert mit CagedKleber-NBD ausgestellt punctata Fluoreszenzemission von ihrem inneren (λExt = 488 nm; Abbildungen 4A und 4 C, grün). Eine analoge Schliffbild erhielt nach Anregung bei 543 nm für rot fluoreszierenden Farbstoff (Zahlen 4 b und 4 C, rot), darauf hinweist, dass CagedKleber-NBD in den Endosomen lokalisiert. Dem…

Discussion

Vorausgegangenen Untersuchungen Licht ausgelöst Translokation von Proteinen in den Zellkern sind mit Käfig NLS⁷^,⁸^,⁹erreicht worden. Wie bereits erwähnt, erfordern diese Methoden zusätzliche Techniken, die NLS-markierten Proteine in das Zytoplasma zu integrieren. Im Gegensatz dazu ermöglicht unser ^Caged-Kleber-R-Tag nicht nur Foto-induzierte nuklearen Translokation, sondern auch zelluläre Aufnahme der Gäste. Die…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir anerkennen das Zentrum für NanoBio Integration, der University of Tokyo. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Beihilfe für junge Wissenschaftler (B) (26810046), K.O. und teilweise unterstützt von Beihilfe für speziell gefördert Forschung (25000005), t.a. r.m. Dank der Research Fellowships der Japan Society für die Förderung der Wissenschaft (JSPS ) für junge Wissenschaftler und das Programm für die führenden Graduate Schools (GPLLI).

Materials

Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm

References

Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

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Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).