Photoactivatable 태그 갇힌된 분자 접착제를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 spatiotemporally 제어

Published: January 17, 2019

doi:

Rina Mogaki, Kou Okuro, Akio Arisaka, Takuzo Aida²

¹Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering,University of Tokyo, ²Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

이 프로토콜에 갇힌된 분자 접착제 태그를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌를 빛 트리거 설명 합니다. 이 방법은 사이트 선택적 핵 타겟팅 약물 전달에 대 한 약속입니다.

Abstract

세포 핵 하나 가장 중요 한 세포의 subcellular 마약 배달 대상으로 유전자 복제의 이후 이며 식 다양 한 질병 치료에 효과적입니다. 여기, 우리를 사용 하 여 고객님의 핵 전 좌 빛 트리거 갇힌 분자 접착제 (^갇힌접착제-R) 태그, 그 여러 guanidinium 이온 (⁺번) 펜 던 트 (낙 산 염 대신 음이온 photocleavable 그룹에 의해 보호 됩니다 설명 nitroveratryloxycarbonyl; ^바 NVOC)입니다. ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그로 손님을 생활 고려 통해 endocytosis 세포 및 endosomes. 그러나, photoirradiation, 시 ^{우리에 갇힌}접착제-R uncaged 분자 접착제 (^Uncaged접착제-R) 여러 번⁺펜 던 트를 들고 endosomal 탈출 및 손님 들의 후속 핵 전 좌 용이로 변환 됩니다. 이 방법은 사이트 선택적 핵 타겟팅 약물 전달에 대 한 약속 때문에 태그 손님 세포질 세포 핵 다음으로 마이그레이션할 수 있습니다 경우에만 photoirradiated. ^갇힌 접착제-R 태그는 작은 분자 손님 뿐만 아니라 고분자 손님 양자 점 (QDs) 등을 제공할 수 있습니다. ^갇힌 접착제-R 태그는 자외선 뿐만 아니라 조직에 깊이 침투 수 2 광자 근처-적외선 (NIR) 빛으로 갇힌 수입니다.

Introduction

유전 정보를 전달, 세포 핵 하나 가장 중요 한 세포의 subcellular 마약 배달 대상으로 유전자 복제의 이후 이며 식 암 등 다양 한 질병 치료에 효과적 이며 유전 장애¹^,²^,³. 약물의 핵 전달, 펩 티 드의 활용 태그 같은 핵 지 방화 신호 (NLS)⁴^,^,⁵⁶ 광범위 하 게 조사 되었습니다. 그러나, 원치 않는 부작용을 줄이기 위해 핵 전 좌의 spatiotemporal 제어 필요 하다.

이전, 빛-트리거 전 좌 단백질의 세포 핵에 갇힌된 NLS⁷^,^,⁸⁹를 사용 하 여 달성 되었습니다. NLS 세포질 수송 단백질⁶에 바인딩하여 세포 핵으로 마이그레이션합니다. 보고 방법에 갇힌된 NLS 베어링 이용 단백질 직접 microinjection⁸ 세포질에 통합 또는 유전자 코드 확장 기법⁹를 사용 하 여 대상 셀에 표현. 따라서, 세포질 통풍 관 및 사진 유도 핵 전 좌를 얻을 수 있는 방법을 실용적인 응용 프로그램에 대 한 유리 하다.

여기, 우리 수지상 갇힌된 분자 접착제 (^{우리에 갇힌}접착제-R, 그림 1) 태그를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 빛 트리거 설명 합니다. 수용 성 분자 접착제¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,^,¹⁷¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ 여러 번⁺ 펜 던 트 베어링 이전 개발 되었습니다는 단단히 단백질¹¹^,¹²^,¹³^,^,¹⁴¹⁵^{, 준수} ¹⁶^,¹⁷, 핵 산¹⁸^,^,¹⁹²⁰, 인지질 막²¹및 찰 흙 nanosheets²²^,²³ 통해는 그들의 구⁺ 펜 던 트 및 대상에 oxyanionic 그룹 사이의 여러 염 다리의 형성. ^{우리에 갇힌}접착제-R의 구⁺ 펜 던 트 음이온 photocleavable 그룹, 낙 산 염 대체 nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC)에 의해 보호 됩니다. ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그로 손님을 생활 고려 통해 endocytosis 및 endosomes (그림 2)에서 세포. Photoirradiation에 ^바NVOC 그룹의 ^{우리에 갇힌}접착제-R는 uncaged 분자 접착제 (^Uncaged접착제-R) 여러 번⁺ 펜 던 트를 들고 다음 태그 이용의 마이그레이션을 용이 하 게 하를 떨어뜨려합니다 에 세포질 세포 핵 (그림 2)에 의해 따라. ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그는 UV 또는 심각한 phototoxicity 없이 2 광자 근처-적외선 (NIR) 빛에 노출에 의해 갇힌 수입니다. 양자 점 (QDs) 및 형광 염료 (nitrobenzoxadiazole;를 사용 하 여 ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그, 작은 분자의 손님 뿐만 아니라 고분자 손님 spatiotemporally 제어 핵 전달 설명 NBD), 예제로 각각.

^{우리에 갇힌}접착제-R.의 도식 구조를 그림 1: 9 guanidinium 이온 (⁺번) 펜 던 트 ^{우리에 갇힌}접착제-R의 낙 산 염 대체 nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC) 그룹에 의해 보호 됩니다. ^BANVOC 그룹은 UV 또는 2 광자 NIR 빛 조사에 의해 죽 습. ^{우리에 갇힌}접착제-R의 초점 핵심은 공업화 nitrobenzoxadiazole (NBD) 또는 dibenzocylooctyne (DBCO). 참조²⁰허가 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 고객님의 핵 전 좌 빛 발생의 개요 그림 ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그 활용. 손님이^{우리에 갇힌}접착제-R 공액 생활으로 채택 / 셀 통해 endocytosis. Photoirradiation에 ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그는 태그의 endosomal 탈출을 용이 하 게 수 한 ^Uncaged접착제-R 태그를 감 금. 그 후, 태그 이용 세포 핵으로 마이그레이션합니다. 참조²⁰허가 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Protocol

1. 준비 갇힌접착제-R와 함께 고객님의 태그 우리에 갇힌접착제 NBD 솔루션을 준비 합니다. 우리에 갇힌접착제-NBD (그림 1) 다음 절차를 앞에서 설명한20음성 합성. 우리에 갇힌접착제-NBD (10mm) 건조 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 재고 솔루션을 준비 합니다.참고: 어둠 속에서 재고 솔루션을 저장 합니다. 솔…

Representative Results

Photoirradiation, 전에 우리에 갇힌접착제 NBD와 incubated Hep3B 세포 전시 그들의 내부에서 punctate 형광 방출 (λext = 488 nm; 그림 4A 고 4 C, 녹색). 유사한 현미경 사진 543에서 여기에 얻은 우리에 갇힌접착제 NBD는 endosomes에 지역화 나타내는 빨간색 형광 염료 (그림 4B , 4c, 빨간색)에 대 한 …

Discussion

빛-트리거 전 좌 단백질의 세포 핵으로의 이전 조사 갇힌된 NLS⁷^,^,⁸⁹를 사용 하 여 달성 되었습니다. 앞에서 설명 했 듯이, 이러한 방법을 세포질에 NLS 태그 단백질 통합을 추가 기술 해야 합니다. 반면, 우리의 ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그 사진 유도 핵 전 좌 뿐만 아니라 손님 들의 세포질 통풍 관을 수 있습니다. 이 ^우?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 NanoBio 통합, 도쿄의 대학에 대 한 중심을 인정합니다. 이 작품은 특정 여 대 한 젊은 과학자 (B) (26810046)를 ko로 부분적으로에서 및 지원 특정 특별히 승진 연구 (25000005)에 대 한 T.A. R.M. 덕분에 일본 사회 연구 장학 과학 (JSP의 승진에 대 한 ) 젊은 과학자와 최고의 대학원 (GPLLI) 프로그램에 대 한.

Materials

Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm

References

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Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).