時空ゲスト活性型タグとしてケージの分子接着剤を用いた生細胞内の核内移行を制御

Published: January 17, 2019

doi:

Rina Mogaki, Kou Okuro, Akio Arisaka, Takuzo Aida²

¹Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering,University of Tokyo, ²Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

このプロトコルでは、ケージ分子接着剤タグを使用して生きている細胞での核内移行を光トリガーについて説明します。このメソッドは、サイト選択的核ターゲットドラッグデリバリーの有望です。

Abstract

細胞核は、遺伝子の複製の変調から最も重要な細胞内小器官の一つを細胞内薬物送達ターゲットとして、式は様々な疾患の治療に有効です。ここでは、光トリガー核移行を利用するお客様のケージが複数のためイオン (Gu⁺) ペンダント (酪酸置換アニオン光分解性グループによって保護されて分子接着剤 (^ケージ接着剤 R) タグを紹介します。nitroveratryloxycarbonyl;^BANVOC)。^{ボールリテーナ入り}接着剤-R が付いたお客様は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスによってエンドソームのまま。しかし、光照射に伴い、^{ボールリテーナ入り}接着剤-R がアンケージ分子接着剤 (^Uncaged接着剤-R) 複数の区⁺ペンダントを運ぶエンドソーム脱出とゲストの後の核移行を容易にするに変換されます。このメソッドは、タグ付けのお客様は細胞核に続いて細胞質に移行できますので核ターゲットサイト選択の薬物送達のための有望な場合にのみ長。^ケージ接着剤 R タグは、小分子のお客様だけでなく、量子ドット (Qd) など高分子のゲストを提供できます。^ケージ接着剤 R タグは紫外線だけでなく、組織に深く浸透することができます, 二光子励起近赤外線 (NIR) ライトとケージですることができます。

Introduction

遺伝情報を運ぶ、細胞核の 1 つ最も重要な細胞内小器官細胞内薬物送達ターゲットとして遺伝子複製の変調から式は、がんを含むさまざまな病気の治療に有効と遺伝¹^,²^,^{3 を}障害します。薬のデリバリー、ペプチドの活用は、ような核局在化信号 (NLS)⁴^,⁵^,⁶が広く検討されているタグを付けます。ただし、望ましくない副作用を減らすために核移行の時空間的制御が必要です。

以前は、ケージ NLS⁷^,⁸^,⁹を使用して、細胞の核蛋白質の光トリガー転流を実現しています。NLS は、⁶細胞質輸送タンパク質に結合して細胞核に移行します。報告の方法でケージの NLS を軸受ゲスト蛋白質はマイクロインジェクション⁸で細胞質に組み込まれてまたは遺伝コードの拡張手法⁹を使用してターゲット細胞で発現直接。したがって、細胞内取り込みと光誘起核移行を実現できる手法は実用的なアプリケーションのために有利です。

ここで、細胞樹状突起のケージ分子接着 (^{ボールリテーナ入り}接着剤-R は、図 1) タグを使用してお客様の核内移行を光トリガーをについて説明します。水溶性の分子接着剤¹⁰^、¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,タンパク質¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^{、しっかりと接着した²³複数区⁺ペンダントをベアリングが以前開発されています。} ¹⁶^,¹⁷, 核酸¹⁸^,¹⁹^、²⁰、リン脂質膜²¹、そして粘土ナノシート²²^,²³を通じて、複数の塩橋区⁺ペンダントとターゲットにされグループの形成。^{ボールリテーナ入り}接着剤-R の区⁺ペンダントは光分解性陰イオングループ、酪酸置換 nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC) によって保護されています。^{ボールリテーナ入り}接着剤-R が付いたお客様は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスによってエンドソーム (図 2) でご滞在。光照射に伴い、^{ボールリテーナ入り}接着剤-R の^BANVOC グループは、アンケージ分子接着剤 (^Uncaged接着剤-R) 複数の区⁺ペンダントを運ぶタグゲストの移行を容易に屈する戸建します。細胞質は細胞核 (図 2) が続きます。^{ボールリテーナ入り}接着剤 R タグが紫外線や深刻な毒性なし二光子励起近赤外線 (NIR) ライトへの露出によってケージですることができます。高分子のお客様だけでなく、小分子^{ボールリテーナ入り}接着剤 R タグ量子ドット (Qd) と蛍光色素 (nitrobenzoxadiazole; を使用してお客様の時空制御の核配信を紹介します。NBD) の例として、それぞれ。

^{ボールリテーナ入り}接着剤-R の図 1: 概略構造^{ボールリテーナ入り}接着剤-R の 9 のためのイオン (Gu⁺) ペンダントが酪酸置換 nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC) グループによって保護されています。^BANVOC グループは二光子励起近赤外光照射によって裂かれます。^{ボールリテーナ入り}接着剤研究の焦点のコアは nitrobenzoxadiazole (NBD) または dibenzocylooctyne (DBCO) のいずれかで修飾します。参照²⁰から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: お客様の核内移行を光トリガーの模式図^{ボールリテーナ入り}接着剤 R タグを持つ共役します。ゲスト/^{ボールリテーナ入り}接着剤 R 共役は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスを介して。光照射に伴い、^{ボールリテーナ入り}接着剤 R タグはタグゲストのエンドソーム脱出を容易にすることができます^Uncaged接着剤 R タグを生成するケージではありません。その後、タグ付けのゲストは、細胞核に移行します。参照²⁰から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Protocol

1. 接着剤-R のケージでお客様の準備のタグします。ボールリテーナ入り接着剤 NBD ソリューションを準備します。ボールリテーナ入り接着剤 NBD (図 1) を次の手順に説明した20を合成します。乾燥ジメチルスルホキシド (DMSO) でボールリテーナ入り接着剤-NBD (10 mM) の原液を準備します。注: は、?…

Representative Results

、光照射前にボールリテーナ入り接着剤 NBD と培養 Hep3B 細胞展示、インテリアから点状蛍光性の放出 (λext = 488 nm;図 4 aと4 C、緑)。543 で励起による得られた類似の顕微鏡写真、エンドソームにボールリテーナ入り接着剤 NBD がローカライズされているを示す赤色蛍光色素 (図 4 b 4 C<…

Discussion

タンパク質の光トリガーの転流、細胞の核の前の調査は、ケージ NLS⁷^,⁸^,⁹を使用して達成されています。前述したように、これらのメソッドに NLS タグ付きタンパク質の細胞質を組み込む付加的な技術が必要です。対照的に、私たち^{ボールリテーナ入り}接着剤 R タグにより誘起核移行だけでなく、ゲストの細胞内取?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ナノバイオの統合、東京の大学中心を認めます。この作品は文部の若手研究 (B) (26810046) k. o. して、部分的にサポート費補助金特別推進研究 (25000005). a. r. m. のおかげで日本社会の研究奨学金のための科学振興) 若手研究者の博士課程教育リーディング (GPLLI) のためのプログラム。

Materials

Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm

References

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Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).