Spatiotemporally controllato traslocazione nucleare di ospiti in cellule viventi utilizzando colle molecolare in gabbia come tag fuse

Published: January 17, 2019

doi:

Rina Mogaki, Kou Okuro, Akio Arisaka, Takuzo Aida²

¹Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering,University of Tokyo, ²Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

Questo protocollo descrive la traslocazione nucleare attivato luce di ospiti in cellule viventi utilizzando tag colla molecolare in gabbia. Questo metodo è promettente per il nucleare-targeting selettivo sito drug delivery.

Abstract

Il nucleo cellulare è uno degli organelli più importanti come obiettivo subcellulare della droga consegna, dalla modulazione della replica di gene ed espressione è efficace per il trattamento di varie malattie. Qui, dimostriamo che la traslocazione nucleare attivato luce degli ospiti usando in gabbia Tag colla molecolare (^Cagedcolla-R), cui più pendenti di guanidinium ione (Gu⁺) sono protetti da un gruppo di photocleavable anionici (butirrato-sostituiti nitroveratryloxycarbonyl; ^BA NVOC). Gli ospiti con etichettati ^Cagedcolla-R sono presi in vita le cellule tramite endocitosi e rimangono in endosomi. Tuttavia, al momento photoirradiation, ^Cagedcolla-R è convertito in uncaged molecolare colla (^Uncagedcolla-R) che trasportano più pendenti Gu⁺, che facilita la fuga endosomal e conseguente traslocazione nucleare degli ospiti. Questo metodo è promettente per il nucleare-targeting selettivo sito drug delivery, poiché gli ospiti con tag possono migrare nel citoplasma seguito da nucleo cellulare solo quando photoirradiated. ^{In gabbia} Tag: colla-R in grado di fornire macromolecolari ospiti come punti quantici (QD) così come gli ospiti della piccolo-molecola. ^{In gabbia} Tag: colla-R può essere uncaged con non solo luce UV, ma anche luce di due fotoni vicino infrarosso (NIR), che possa penetrare in profondità nel tessuto.

Introduction

Il nucleo delle cellule, che porta le informazioni genetiche, è uno degli organelli più importanti come obiettivo subcellulare della droga consegna, dalla modulazione della replica di gene ed espressione è efficace per il trattamento di varie malattie tra cui il cancro e genetica disordini di¹^,²^,³. Per consegna nucleare delle droghe, coniugazione di peptide tag come localizzazione nucleare (NLS) di segnali⁴^,⁵^,⁶ è stato ampiamente studiato. Tuttavia, al fine di ridurre gli effetti collaterali indesiderati, controllo spazio-temporale della traslocazione nucleare è necessario.

In precedenza, ha attivato luce traslocazione delle proteine nel nucleo delle cellule è stato raggiunto utilizzando in gabbia NLS⁷^,⁸^,⁹. NLS migra nel nucleo cellulare legandosi a proteine di trasporto citoplasmico⁶. Nei metodi segnalati, proteine ospite NLS in gabbia del cuscinetto sono direttamente incorporati nel citoplasma di microiniezione⁸ o espresso nelle celle di destinazione utilizzando un codice genetico espansione tecnica⁹. Pertanto, un metodo che si può raggiungere sia l’assorbimento cellulare e traslocazione nucleare foto-indotta è vantaggioso per applicazioni pratiche.

Qui, descriviamo la traslocazione nucleare attivato luce di ospiti in cellule viventi utilizzando tag dendritiche colla molecolare in gabbia (^Cagedcolla-R, Figura 1). Solubile in acqua molecolare Colle¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ cuscinetto più pendenti Gu⁺ sono stati sviluppati in precedenza, cui aderiscono strettamente al proteine¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶^,¹⁷, acidi nucleici¹⁸^,¹⁹^,²⁰, fosfolipide membrane²¹e argilla nanosheets²²^,²³ attraverso la Formazione di ponti più sale tra loro pendenti Gu⁺ e oxyanionic gruppi sugli obiettivi. I pendenti di Gu⁺ di ^Cagedcolla-R sono protetti da un gruppo di photocleavable anionici, nitroveratryloxycarbonyl butirrato-sostituiti (^BANVOC). Gli ospiti con etichettati ^Cagedcolla-R sono presi in vita le cellule tramite endocitosi e soggiorno in endosomi (Figura 2). Al momento photoirradiation, i gruppi NVOC ^BAdi ^Cagedcolla-R sono staccati per produrre una uncaged molecolare colla (^Uncagedcolla-R) che trasportano più pendenti Gu⁺ , che poi facilita la migrazione dell’ospite con tag nel citoplasma seguito dal nucleo della cellula (Figura 2). Il tag di colla-R ^Cagedpuò essere uncaged da esposizione a UV o due-fotone vicino infrarosso (NIR) luce senza serio fototossicità. Dimostriamo la consegna nucleare spatiotemporally controllata di ospiti macromolecolari, nonché ospiti della piccolo-molecola con ^CagedTag colla-R, utilizzando punti quantici (QD) ed un colorante fluorescente (nitrobenzoxadiazole; NBD), rispettivamente, come esempi.

Figura 1: Strutture schematiche di ^Cagedcolla-R. I pendenti di ioni (Gu⁺) guanidinium 9 ^Cagedcolla-r sono protetti da un gruppo di nitroveratryloxycarbonyl butirrato-sostituiti (^BANVOC). I gruppi NVOC ^BAsono spaccati da irradiazione con UV o luce di due fotoni NIR. Il nucleo focale della colla ^Caged-R è funzionalizzato con nitrobenzoxadiazole (NBD) o dibenzocylooctyne (DBCO). Ristampato con il permesso di riferimento²⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Illustrazione schematica della traslocazione nucleare attivato luce degli ospiti coniugato con un tag di ^Cagedcolla-R. L’ospite / coniugato colla-R^Cagedè ripreso in vita le cellule tramite endocitosi. Su photoirradiation, il tag di colla-R ^Cagedè uncaged cedere un tag colla-R ^Uncaged, che può facilitare la fuga endosomal dell’ospite con tag. Successivamente, l’ospite con tag migra nel nucleo cellulare. Ristampato con il permesso di riferimento²⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. preparazione degli ospiti con gabbiacolla-R Tag Preparare la soluzione di colla-NBD Caged. Sintetizzare Cagedcolla-NBD (Figura 1) seguendo le procedure precedentemente descritte20. Preparare una soluzione stock di Cagedcolla-NBD (10 mM) a secco dimetilsolfossido (DMSO).Nota: Conservare la soluzione magazzino buio. La soluzione può essere diluita con amplificatori acquosi o terreni di colt…

Representative Results

Prima photoirradiation, Hep3B cellule incubate con Cagedcolla-NBD ha esibito l’emissione di fluorescenza punctate dal loro interno (λext = 488 nm; Figure 4A e 4C, verde). Un Micrografo analogo è stato ottenuto al momento di eccitazione a 543 nm per colorante rosso fluorescente (figure 4B e 4C, rosso), che indica che il Cagedcolla-NBD localizzata negli endosomi….

Discussion

Le indagini precedenti di luce-attivato traslocazione delle proteine nel nucleo delle cellule sono stati raggiunti utilizzando in gabbia NLS⁷^,⁸^,⁹. Come accennato in precedenza, questi metodi richiedono tecniche aggiuntive per incorporare le proteine NLS-etichettate nel citoplasma. Al contrario, nostro tag colla-R ^Cagedconsente non solo la traslocazione nucleare indotta da foto, ma anche l’assorbimento cellulare degli …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo il centro per l’integrazione di NanoBio, l’Università di Tokyo. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzione per giovani scienziati (B) (26810046) per K.O. e parzialmente supportato da sovvenzione per ricerca promosso appositamente (25000005) con T.A. R.M. grazie Research Fellowships di Japan Society per la promozione della scienza (JSPS ) per giovani ricercatori e il programma per scuole laureate leader (GPLLI).

Materials

Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm

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Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).