Spatiotemporally kontrollerade translokationen i cellkärnan gäster i levande celler med bur molekylär lim som Photoactivatable Taggar

Published: January 17, 2019

doi:

Rina Mogaki, Kou Okuro, Akio Arisaka, Takuzo Aida²

¹Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering,University of Tokyo, ²Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

Det här protokollet beskriver ljus-utlöst translokationen i cellkärnan gäster i levande celler med bur molekylär lim-taggar. Denna metod är lovande för webbplats-selektiva kärnvapen-targeting drogen leverans.

Abstract

Cellkärnan är en av de viktigaste organeller som subcellulär drog-leverans mål, sedan modulering av genen replikering och uttryck är effektiv för behandling av olika sjukdomar. Här visar vi ljus-utlöst translokationen i cellkärnan i gäster som använder bur molekylär lim (^Cagedlim-R) Taggar, vars flera guanidinium ion (Gu⁺) hängen skyddas av en anjoniska photocleavable grupp (butyrate-substituerade nitroveratryloxycarbonyl; ^BA NVOC). Gäster med ^Cagedlim-R etiketten tas i levande celler via endocytos och förbli i endosomes. Dock är ^Cagedlim-R vid photoirradiation omvandlas uncaged molekylär lim (^Uncagedlim-R) bär flera Gu⁺hängen, som underlättar endosomal fly och efterföljande translokationen i cellkärnan av gästerna. Denna metod är lovande för webbplats-selektiva kärnvapen-targeting drogen leverans, eftersom de taggade gästerna kan migrera in i cytoplasman följt av cellkärnan endast när photoirradiated. ^Caged Lim-R taggar kan leverera makromolekylära gäster såsom kvantprickar (QDs) samt småmolekylär gäster. ^Caged Lim-R taggar kan vara uncaged med UV-ljus men också två-photon nära infrarött (NIR) ljus, som kan tränga djupt in i vävnaden.

Introduction

Cellkärnan, som bär den genetiska informationen, är en av de viktigaste organeller som subcellulär drog-leverans mål, sedan modulering av genen replikering och uttryck är effektiv för behandling av olika sjukdomar inklusive cancer och genetiska sjukdomar i¹^,²^,³. För nukleära leverans av läkemedel, Konjugation av peptid taggar såsom cellkärnelokalisering signaler (NLS)⁴^,⁵^,⁶ allmänt har undersökts. För att minska oönskade bieffekter, krävs dock spatiotemporal kontroll av translokationen i cellkärnan.

Tidigare, ljus-utlöst flyttning av proteiner i cellkärnan har uppnåtts med bur NLS⁷^,⁸^,⁹. NLS migrerar in i cellkärnan genom bindning till cytoplasmiska transport proteiner⁶. I de rapportera metoderna, är gäst proteiner med bur NLS direkt införlivas i cytoplasman av Mikroskop⁸ eller uttryckt i målcellerna använder en genetisk kod expansion teknik⁹. En metod som kan uppnå både cellernas upptag och foto-inducerad translokationen i cellkärnan är därför fördelaktigt för praktiska tillämpningar.

Häri, beskriver vi ljus-utlöst translokationen i cellkärnan gäster i levande celler med hjälp av dendritiska bur molekylär lim (^Cagedlim-R, figur 1) Taggar. Vattenlösliga molekylär lim¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ med flera Gu⁺ hängen har tidigare utvecklats, som tätt följa proteiner¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶^,¹⁷, nukleinsyror¹⁸^,¹⁹^,²⁰, fosfolipid membran²¹och lera nu²²^,²³ genom den bildandet av flera salt broar mellan deras Gu⁺ hängen och oxyanionic grupper på mål. Gu⁺ Hängen av ^Cagedlim-R skyddas av en anjoniska photocleavable grupp, butyrate-substituerade nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC). Gäster med ^Cagedlim-R etiketten tas i levande celler via endocytos och vistelse i endosomes (figur 2). Vid photoirradiation, är ^BANVOC grupperna av ^Cagedlim-R fristående för att ge en uncaged molekylär lim (^Uncagedlim-R) bär flera Gu⁺ hängen, vilket då underlättar migreringen av märkta gästen i cytoplasman följt av cellkärnan (figur 2). Taggen ^Cagedlim-R kan vara uncaged av exponering för UV- eller två-photon nära infrarött (NIR) ljus utan allvarliga fototoxicitet. Vi visar den spatiotemporally kontrollerade kärn leveransen av makromolekylära gäster samt småmolekylär gäster med ^Cagedlim-R taggar, som använder kvantprickar (QDs) och ett fluorescerande färgämne (nitrobenzoxadiazole; NBD), respektive, som exempel.

Figur 1: Schematisk strukturer av ^Cagedlim-R. 9 guanidinium ion (Gu⁺) Hängen av ^Cagedlim-R skyddas av en butyrate-substituerade nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC) grupp. ^BANVOC grupperna klyvs av bestrålning med UV- eller två-photon NIR ljus. Focal kärnan i ^Cagedlim-R är functionalized med antingen nitrobenzoxadiazole (NBD) eller dibenzocylooctyne (DBCO). Omtryckt med tillåtelse från referens²⁰. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Schematisk illustration av ljus-utlöst translokationen i cellkärnan gäster konjugerat med ett ^Cagedlim-R tag. Gästen /^Cagedlim-R konjugat tas i levande celler via endocytos. Vid photoirradiation är ^Cagedlim-R taggen uncaged ge en ^Uncagedlim-R tagg, som kan underlätta endosomal flykten av märkta gästen. Därefter migrerar märkta gästen in i cellkärnan. Omtryckt med tillåtelse från referens²⁰. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. beredning av gäster med burlim-R Taggar Förbereda Cagedlim-NBD lösning. Syntetisera Cagedlim-NBD (figur 1) efter de tidigare beskrivna förfaranden-20. Förbereda en stamlösning av Cagedlim-NBD (10 mM) i torr dimetyl sulfoxid (DMSO).Obs: Förvara stamlösning i mörkret. Lösningen kan spädas med aqueous buffertar eller cell kulturmassmedia vid användning. Bere…

Representative Results

Innan photoirradiation, uppvisade Hep3B cellerna inkuberas med Cagedlim-NBD punktuell fluorescens utsläpp från sin inre (λext = 488 nm. Figurerna 4A och 4 C, grön). En liknande Mikrograf erhölls vid magnetiseringen på 543 nm för röd fluorescerande färgämne (figurerna 4B och 4 C, röd), som anger att Cagedlim-NBD lokaliserade i endosomes. Följaktligen f…

Discussion

Tidigare undersökningar av ljus-utlöst flyttning av proteiner i cellkärnan har uppnåtts med bur NLS⁷^,⁸^,⁹. Som tidigare nämnts, kräver dessa metoder ytterligare tekniker för att införliva de NLS-märkta proteinerna i cytoplasman. Däremot kan vår ^Cagedlim-R tag inte bara foto-inducerad translokationen i cellkärnan, utan även cellernas upptag av gästerna. Funktionen av taggen ^Cagedlim-R är förde…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi erkänner centrum för NanoBio Integration, University of Tokyo. Detta arbete var stöds av bidrag för unga forskare (B) (26810046) att K.O. och delvis stöds av bidrag för speciellt främjat forskning (25000005) att T.A. R.M. tack Forskning Stipendier Japan samhällets för främjande av vetenskap (JSPS ) för unga forskare och Program för ledande forskarskolor (GPLLI).

Materials

Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm

References

Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).