Det här protokollet beskriver ljus-utlöst translokationen i cellkärnan gäster i levande celler med bur molekylär lim-taggar. Denna metod är lovande för webbplats-selektiva kärnvapen-targeting drogen leverans.
Cellkärnan är en av de viktigaste organeller som subcellulär drog-leverans mål, sedan modulering av genen replikering och uttryck är effektiv för behandling av olika sjukdomar. Här visar vi ljus-utlöst translokationen i cellkärnan i gäster som använder bur molekylär lim (Cagedlim-R) Taggar, vars flera guanidinium ion (Gu+) hängen skyddas av en anjoniska photocleavable grupp (butyrate-substituerade nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gäster med Cagedlim-R etiketten tas i levande celler via endocytos och förbli i endosomes. Dock är Cagedlim-R vid photoirradiation omvandlas uncaged molekylär lim (Uncagedlim-R) bär flera Gu+ hängen, som underlättar endosomal fly och efterföljande translokationen i cellkärnan av gästerna. Denna metod är lovande för webbplats-selektiva kärnvapen-targeting drogen leverans, eftersom de taggade gästerna kan migrera in i cytoplasman följt av cellkärnan endast när photoirradiated. Caged Lim-R taggar kan leverera makromolekylära gäster såsom kvantprickar (QDs) samt småmolekylär gäster. Caged Lim-R taggar kan vara uncaged med UV-ljus men också två-photon nära infrarött (NIR) ljus, som kan tränga djupt in i vävnaden.
Cellkärnan, som bär den genetiska informationen, är en av de viktigaste organeller som subcellulär drog-leverans mål, sedan modulering av genen replikering och uttryck är effektiv för behandling av olika sjukdomar inklusive cancer och genetiska sjukdomar i1,2,3. För nukleära leverans av läkemedel, Konjugation av peptid taggar såsom cellkärnelokalisering signaler (NLS)4,5,6 allmänt har undersökts. För att minska oönskade bieffekter, krävs dock spatiotemporal kontroll av translokationen i cellkärnan.
Tidigare, ljus-utlöst flyttning av proteiner i cellkärnan har uppnåtts med bur NLS7,8,9. NLS migrerar in i cellkärnan genom bindning till cytoplasmiska transport proteiner6. I de rapportera metoderna, är gäst proteiner med bur NLS direkt införlivas i cytoplasman av Mikroskop8 eller uttryckt i målcellerna använder en genetisk kod expansion teknik9. En metod som kan uppnå både cellernas upptag och foto-inducerad translokationen i cellkärnan är därför fördelaktigt för praktiska tillämpningar.
Häri, beskriver vi ljus-utlöst translokationen i cellkärnan gäster i levande celler med hjälp av dendritiska bur molekylär lim (Cagedlim-R, figur 1) Taggar. Vattenlösliga molekylär lim10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 med flera Gu+ hängen har tidigare utvecklats, som tätt följa proteiner11,12,13,14,15, 16,17, nukleinsyror18,19,20, fosfolipid membran21och lera nu22,23 genom den bildandet av flera salt broar mellan deras Gu+ hängen och oxyanionic grupper på mål. Gu+ Hängen av Cagedlim-R skyddas av en anjoniska photocleavable grupp, butyrate-substituerade nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Gäster med Cagedlim-R etiketten tas i levande celler via endocytos och vistelse i endosomes (figur 2). Vid photoirradiation, är BANVOC grupperna av Cagedlim-R fristående för att ge en uncaged molekylär lim (Uncagedlim-R) bär flera Gu+ hängen, vilket då underlättar migreringen av märkta gästen i cytoplasman följt av cellkärnan (figur 2). Taggen Cagedlim-R kan vara uncaged av exponering för UV- eller två-photon nära infrarött (NIR) ljus utan allvarliga fototoxicitet. Vi visar den spatiotemporally kontrollerade kärn leveransen av makromolekylära gäster samt småmolekylär gäster med Cagedlim-R taggar, som använder kvantprickar (QDs) och ett fluorescerande färgämne (nitrobenzoxadiazole; NBD), respektive, som exempel.
Figur 1: Schematisk strukturer av Cagedlim-R. 9 guanidinium ion (Gu+) Hängen av Cagedlim-R skyddas av en butyrate-substituerade nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) grupp. BANVOC grupperna klyvs av bestrålning med UV- eller två-photon NIR ljus. Focal kärnan i Cagedlim-R är functionalized med antingen nitrobenzoxadiazole (NBD) eller dibenzocylooctyne (DBCO). Omtryckt med tillåtelse från referens20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk illustration av ljus-utlöst translokationen i cellkärnan gäster konjugerat med ett Cagedlim-R tag. Gästen /Cagedlim-R konjugat tas i levande celler via endocytos. Vid photoirradiation är Cagedlim-R taggen uncaged ge en Uncagedlim-R tagg, som kan underlätta endosomal flykten av märkta gästen. Därefter migrerar märkta gästen in i cellkärnan. Omtryckt med tillåtelse från referens20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tidigare undersökningar av ljus-utlöst flyttning av proteiner i cellkärnan har uppnåtts med bur NLS7,8,9. Som tidigare nämnts, kräver dessa metoder ytterligare tekniker för att införliva de NLS-märkta proteinerna i cytoplasman. Däremot kan vår Cagedlim-R tag inte bara foto-inducerad translokationen i cellkärnan, utan även cellernas upptag av gästerna. Funktionen av taggen Cagedlim-R är förde…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner centrum för NanoBio Integration, University of Tokyo. Detta arbete var stöds av bidrag för unga forskare (B) (26810046) att K.O. och delvis stöds av bidrag för speciellt främjat forskning (25000005) att T.A. R.M. tack Forskning Stipendier Japan samhällets för främjande av vetenskap (JSPS ) för unga forskare och Program för ledande forskarskolor (GPLLI).
Azide-PEG4-NHS ester | Click Chemistry Tools | AZ103 | |
Q-dot 655 ITK | Invitrogen | Q21521MP | |
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) | NIPPON Genetics | TOR-3K | |
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) | Harvard Apparatus | 7425-RC25K | |
Hep3B Cells | ATCC | HB-8064 | |
8-chambered glass substrate | Nunc | 155411JP | |
96-well culture plate | Nunc | 167008 | |
Eagle's minimal essential medium (EMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10370-021 | |
Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare | SH30406.02 | |
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) | Wako Pure Chemical Industries | 045-29795 | |
LysoTracker Red | Lonza Walkersville | PA-3015 | |
Hoechst 33342 | Dojindo | H342 | |
Cell Counting Kit-8 | Dojindo | CK04 | |
Confocal laser scanning microscope | Carl-Zeiss | LSM 510 | Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics) |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
Xenon light source | Asahi Spectra | LAX-102 | |
Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax Paradigm |