Spatiotemporally контролируемых ядерных транслокации гостей в живых клеток с помощью клетке молекулярный клей как Photoactivatable Теги

Published: January 17, 2019

doi:

Rina Mogaki, Kou Okuro, Akio Arisaka, Takuzo Aida²

¹Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering,University of Tokyo, ²Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

Этот протокол описывает свет срабатывает ядерной транслокации гостей в живых клеток с помощью тегов клетке молекулярный клей. Этот метод является перспективным для сайта селективные таргетинг доставки лекарств.

Abstract

Клеточное ядро является одним из наиболее важных органеллы как цель субцеллюлярные доставки лекарств, после модуляции гена репликации и выражение является эффективным для лечения различных заболеваний. Здесь мы демонстрируем, что свет срабатывает ядерной транслокации гостей с помощью клетке Теги молекулярный клей (^Cagedклей-R), анионные photocleavable группой (бутират замещенных защищены которого несколько подвески Ион (ГУ⁺) Гуанидиновые nitroveratryloxycarbonyl; ^Ба NVOC). Гости, отмеченных ^Cagedклей-R учитываются живых клеток через эндоцитоза и остаются в endosomes. Однако после хлорином, ^Cagedклей-R преобразуется в отключенную молекулярный клей (^Uncagedклей-R) проведение нескольких ГУ⁺подвески, которая облегчает побег от англ и последующих ядерных транслокации гостей. Этот метод является перспективным для доставки лекарств сайт селективные таргетинг, поскольку тегами гости могут мигрировать в цитоплазме, следуют клеточного ядра только при photoirradiated. ^{В клетке} Клей-R Теги могут доставить макромолекулярных гостей, таких как квантовых точек (QDs) а также мелкомолекулярных гостей. ^{В клетке} Клей-R Теги могут быть отключенную с не только УФ-излучения, но и двух Фотон ближней ИК-области спектра (NIR) света, который может глубоко проникают в ткани.

Introduction

Клеточное ядро, которое несет генетическую информацию, является одним из наиболее важных органеллы как цель субцеллюлярные доставки лекарств, с модуляции гена репликации и выражение является эффективным для лечения различных заболеваний, включая рак и генетических расстройства,¹^,²^,³. Для доставки ядерного оружия, наркотиков спряжение пептида теги, такие, как широко исследована ядерной локализации сигналов (NLS)⁴^,⁵^,⁶ . Однако для того чтобы уменьшить нежелательные побочные эффекты, пространственно-временных контроль ядерных транслокации является необходимым.

Ранее был достигнут свет срабатывает транслокации белка в ядре клетки, с помощью NLS клетке⁷^,⁸^,⁹. NLS мигрирует в ядре клетки путем связывания белков цитоплазматического транспорта⁶. В сообщаемых методов гость белки, принимая клетке NLS непосредственно включены в цитоплазме микроинъекции⁸ или выраженные в целевой ячейки, используя метод расширения генетического кода⁹. Таким образом метод, который можно достичь клеточного поглощения и фото индуцированной ядерной транслокации выгодно для практического применения.

Здесь мы описываем свет срабатывает ядерной транслокации гостей в живых клеток с помощью тегов дендритных клетках молекулярный клей (^Cagedклей-R, рис. 1). Водорастворимые клеи молекулярной¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,^,¹⁵¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ , принимая несколько ГУ⁺ подвески ранее разработаны, который жестко придерживаться белков¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶^,¹⁷, нуклеиновые кислоты¹⁸^,¹⁹^,²⁰, фосфолипидов мембран²¹и глины nanosheets²²^,²³ через формирование нескольких соли мостов между их подвески ГУ⁺ и oxyanionic группами на цели. ГУ⁺ подвески ^Cagedклей-R защищены анионные photocleavable группой, бутират замещенных nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC). Гости, отмеченных ^Cagedклей-R учитываются живых клеток через эндоцитоза и пребывания в endosomes (рис. 2). После хлорином ^БаNVOC групп ^Cagedклей-R отсоединены приносить отключенную молекулярный клей (^Uncagedклей-R) перевозящих несколько ГУ⁺ подвески, которая затем способствует миграции тегами гостя в цитоплазме, следуют клеточного ядра (рис. 2). ^Cagedклей-R тег может быть отключенную под воздействием УФ или два Фотон ближней ИК-области спектра (NIR) света без серьезных Фототоксичность. Мы демонстрируем spatiotemporally контролируемых ядерных поставок макромолекулярных гостей, а также мелкомолекулярных гостей с ^Cagedклей-R теги, использование квантовых точек (QDs) и флуоресцентные краски (nitrobenzoxadiazole; NBD), соответственно, в качестве примеров.

Рисунок 1: Схема структуры ^Cagedклей-р. 9 Гуанидиновые Ион (ГУ⁺) подвески ^Cagedклей-r защищены группой бутират замещенных nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC). Группы NVOC ^Барасщепляется при облучении УФ или два Фотон NIR света. Суть фокуса ^Cagedклей-R функционализированных с nitrobenzoxadiazole (NBD) или dibenzocylooctyne (DBCO). Перепечатано с разрешения ссылки²⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Схематическое изображение света срабатывает ядерной транслокации гостей конъюгированных с тегом клей-R ^Caged. Гость /^Cagedклей-R конъюгата учитывается живых клеток через эндоцитоз. После хлорином клей-R тег ^Cagedотключенную приносить тег клей-R ^Uncaged, который может облегчить побег от англ тегами гостя. Впоследствии помеченный гость мигрирует в ядре клетки. Перепечатано с разрешения ссылки²⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

1. Подготовка гостей с клеткеклей R Теги Готовят раствор клея-NBD Caged. Синтезировать Cagedклей-NBD (рис. 1) после ранее описанные процедуры20. Подготовьте Стоковый раствор Cagedклей-NBD (10 мм) в сухом диметилсульфоксида (ДМСО).Прим…

Representative Results

Перед хлорином, Hep3B клетки инкубировали с Cagedклей-NBD выставлены пунктата флуоресценции выбросов от их интерьер (λext = 488 нм; 4A цифры и 4 C, зеленый). Аналогичных Микрофотография был получен после возбуждения в 543 Нм для красно Люминесцентн?…

Discussion

Предыдущие исследования-срабатывает транслокации белка в ядре клетки были достигнуты с помощью NLS клетке⁷^,⁸^,⁹. Как упоминалось ранее, эти методы требуют дополнительных методов включения NLS-тегами белков в цитоплазме. В противоположност?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем центр для NanoBio интеграции, Университет Токио. Эта работа была поддерживается за счет целевых субсидий для молодых ученых (B) (26810046) К.О и частично поддерживается субсидий специально поощрять исследований (25000005) т.а. R.M. Спасибо исследовательские стипендии Японии общества для поощрения науки (JSP ) для молодых ученых и программы для ведущих выпускник школ (GPLLI).

Materials

Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm

References

Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).