基于多步法链位移光刻的基因功能表面固定化研究
Summary
我们描述了一种简单的光刻程序, 用于固定在表面上的基因长度 DNA 分子, 可用于在生物芯片上执行无细胞基因表达实验。
Abstract
光刻结构表面上的基因固定化可以研究开放微流控生物反应器系统中的分割基因表达过程。与其他用于人工蜂窝系统的方法相反, 这种设置允许使用基因表达试剂和同时排出废物产品的持续供应。这有助于在较长时间内实现无细胞基因表达过程, 这对于实现动态基因调控反馈系统非常重要。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 用于制造遗传生物芯片使用一种简单易用的平版印刷技术, 基于 DNA 链位移反应, 专门使用商业上可用的组件。我们还提供了一个关于将分型基因与基于硅油 (PDMS) 的微流控系统相结合的协议。此外, 我们还表明该系统与全内部反射荧光 (TIRF) 显微镜相兼容, 可用于直接观察 DNA 与表达混合中所含分子之间的分子相互作用。
Introduction
无细胞基因表达反应对生物化学、生物技术和合成生物学的各种应用都有很大的兴趣。蛋白质的无细胞表达有助于制备纯蛋白样品, 这是结构生物学中大量研究的基础。例如, 无细胞系统被成功地用于蛋白配合物1或膜蛋白2的表达, 这是很难用细胞表达的方式产生的。值得注意的是, 无细胞基因表达反应也被用来阐明基因编码的结构, 从尼伦伯格分享和 Matthaei 在 1961年3的开创性实验开始。
最近, 对生物技术和合成生物学中的无细胞方法的兴趣重新开始了4,5,6。无细胞系统可以用非生物化合物来增强, 不同生物来源的成分可以更容易地结合起来7。即使无细胞系统有明显的劣势, 他们不 “生长和分裂”, 它是可以想象的准备开放无细胞生物反应器与基本代谢功能, 让他们合成代谢物, 当提供简单的碳和能量输入8。在合成生物学的新兴领域内, 无细胞系统有望成为实现合成生物学功能的更可预测的 “底盘”。
目前, 无细胞基因表达反应是使用细胞提取物 (从细菌、酵母、昆虫等不同来源) 或转录/翻译系统进行的, 这些都是针对不同应用进行优化的 (例如,原核与真核基因的表达, 膜蛋白的生产等)。最近由 v. Noireaux 和同事9提供了一种用于制备细菌细胞萃取物 (通常称为 TXTL) 的流行协议。其生物物理特性已被彻底地表征为10, TXTL 系统已经成功地用于执行一系列复杂的生化任务:例如, 通过无细胞表达的噬菌体基因组11, 合成细菌蛋白花丝12, 或实施无细胞基因电路13,14。
在无细胞合成生物学中流行的另一个系统是纯系统, 它是从纯化的成分15,16重组。与 TXTL 系统相比, 它不含核酸酶或蛋白质降解机械。虽然线性 DNA 的降解, RNA 分子或蛋白质在纯系统中是较少的问题, 衰变通路实际上是重要的执行动态功能。为了减少线性基因模板在 TXTL 系统中外切酶降解的影响 (通过 RecBCD), 必须添加末端保护 GamS 蛋白。TXTL 和纯系统均可在商业上使用。
与无细胞生物学密切相关的一个话题涉及对生物化学反应进行划分的影响的研究, 以及进一步创建人工细胞样结构或原始细胞17,18,19 ,20。人工细胞的研究通常涉及在由磷脂或其他双亲制成的水泡夹层内的生化反应系统的封装。虽然这些系统有助于探讨划分的基本方面, 或细胞构成和自复制结构的出现, 但它们面临着封闭系统的典型问题: 在缺乏正常新陈代谢和适当膜传输机制, 很难保持分割反应运行的长时间-燃料分子被耗尽和废品积累。
在这种细胞模拟的隔间内进行划分的一个有趣的替代方法是使用光刻法的基因材料的空间组织。在十年前的魏兹曼研究所, Ziv 集团率先将 “芯片上的基因” 固定在21。必须解决的主要问题之一是 DNA 的非特异吸附和芯片表面蛋白质的潜在变性。Ziv等开发了一个专门的光刻抗称为 “雏菊”, 这是由反应终端硅烷固定在二氧化硅表面的抗分子, 一个长聚乙烯乙二醇 (PEG) 垫片, 确保生物相容性, 和 photocleavable 头, 它被转换成反应胺在辐照紫外线 (UV) 光。结果表明, 菊花可用于固定基因长度的 DNA 分子 (长度为几公斤碱基对 (kbp)) 在芯片表面上。从高分子物理学的角度来看, 这些系统代表了在固体基底上接枝的聚合物画笔。由于 DNA 的聚电解质性质, 这些画笔的构象受到渗透和其他离子特异效应22,23的强烈影响。
最重要的是, 它已经表明, 基底固定化基因仍然是功能性的, 可以转录和转化成 RNA 和蛋白质。基因画笔可从溶液24中获得 RNA 聚合酶, 而转录/平移的复杂大分子混合物不会在表面变性。固定在基板上的遗传成分的优点之一是, 它们可以在一个开放的微流体反应器系统中运行, 并持续提供小的前体分子, 并可从中去除废料25,26。
我们最近开发了这种方法的变体称为 Bephore (用于生物相容性电子束和光刻胶)27, 它完全基于商业上可用的组件和使用序列特定的 DNA 链侵入反应实现了一种简单实现的多步骤光刻程序, 用于创建基于芯片的人工细胞。该过程的示意图概述如图 1所示。它是基于 DNA 发夹分子包含 photocleavable 组, 这是固定在生物相容的 PEG 层。Photocleavage 的发夹暴露一个单链立足点序列, 通过它的 DNA 分子的兴趣 (包含 “置换” DIS 序列) 可以通过立足点介导的链侵入连接。
虽然 Bephore 的实现可能更简单, 但菊花允许实现非常致密和干净的 “基因画笔”, 这在某些应用中具有优势。然而, 在原则上, 菊花和 Bephore 光刻可以很容易地结合。利用 dna 链位移的相关光刻方法, 对金的 dna 画笔进行了构造, 但未在无细胞基因表达28、29的背景下使用。
在下面的协议中, 我们提供了使用 Bephore 方法对无细胞基因表达进行 DNA 笔刷生产的详细描述。我们描述了基因芯片是如何制造的, 并展示了多步光光刻在芯片上的空间结构化固定化中的应用。我们还讨论了反应腔的制备及微流体在片内基因表达反应中的应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
Bephore 光刻技术是一种强大而通用的方法, 用于 DNA 或 RNA 的图案固定化。然而, 该过程包括几个步骤, 如果发生更改, 则可能是系统故障或性能降低的原因。
制造 Bephore 芯片的关键步骤是基底的聚乙二醇化, 它提供了表面的生物相容性。在这里, 使用 RCA 过程的清理步骤非常重要, 因为它还激活了后续硅烷化的表面。在实际聚乙二醇化中, 基体不能干燥。此外, 硅烷 PEG-生物素必须?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢大众基金会 (89 883) 和欧洲研究理事会 (赠款协议 no. 694410-AEDNA) 对该项目的财政支持。硕士学位。确认通过 GRK 2062 的支持。
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
References
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