Superficie-Inmovilización funcional de Genes utilizando litografía de desplazamiento de varias fases de la cadena
Summary
Se describe un sencillo procedimiento litográfico para la inmovilización de las moléculas de ADN del gen-longitud sobre una superficie, que puede utilizarse para llevar a cabo experimentos de expresión génica sin células en biochips.
Abstract
Inmovilización de genes en superficies litográfico estructurados permite el estudio del gen compartimentado procesos de expresión en un sistema de biorreactor de microfluidos abierto. En contraste con otros enfoques hacia sistemas celulares artificiales, tal configuración permite un suministro continuo con gene expresión reactivos y drenaje simultáneo de productos de desecho. Esto facilita la implementación de procesos de expresión génica sin células durante largos períodos de tiempo, lo cual es importante para la realización de sistemas de retroalimentación reguladora de genes dinámico. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la fabricación de biochips genéticos utilizando una técnica litográfica de simple-to-use basada en reacciones de desplazamiento de hebra de ADN, que utiliza exclusivamente los componentes comercialmente disponibles. También proporcionamos un protocolo sobre la integración de genes compartimentadas con un polidimetilsiloxano (PDMS)-sistema de microfluidos. Por otra parte, nos muestran que el sistema es compatible con microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total, que puede ser utilizado para la observación directa de las interacciones moleculares entre el ADN y las moléculas contenidas en la mezcla de la expresión.
Introduction
Libre expresión génica, las reacciones son de gran interés para diversas aplicaciones en Bioquímica, biotecnología y biología sintética. Libre expresión de las proteínas fue instrumental para la preparación de las muestras de proteína pura, que fueron la base para numerosos estudios de biología estructural. Por ejemplo, sistemas libres de células fueron utilizados con éxito para la expresión de la proteína complejos1 o membrana proteínas2, que son difíciles de producir con la expresión de la célula. En particular, libre expresión génica reacciones también fueron utilizadas para dilucidar la estructura del código genético, a partir de los experimentos innovadores de Nirenberg y Matthaei en 19613.
Recientemente, ha habido un renovado interés en métodos sin células en biotecnología y biología sintética4,5,6. Sistemas libres de células pueden ser aumentados con compuestos no-biológica, y componentes de origen biológico distinto pueden combinarse más fácilmente7. A pesar de sistemas libres de células tienen la desventaja evidente que no es “crecer y dividir”, es concebible para preparar Biorreactores abiertos libres de células con funciones metabólicas básicas y que sintetizan metabolitos cuando provisto de energía y carbono simple entradas8. Dentro del campo emergente de la biología sintética, sistemas libres de células prometen ser un “chasis” más predecible para la ejecución de funciones biológicas sintético.
Actualmente, las reacciones de expresión de genes sin células se llevan a cabo usando los extractos de célula (de diferentes fuentes tales como bacterias, levaduras, insectos), o sistemas de transcripción y traducción que fueron optimizados para diferentes aplicaciones (por ejemplo, procariotas vs. eucariotas la expresión génica, la producción de proteínas de membrana, etc.). Un popular protocolo para la preparación del extracto de la célula bacteriana (comúnmente llamados TXTL) fue proporcionado recientemente por V. Noireaux y compañeros de trabajo9. Sus propiedades biofísicas han sido completamente caracterizados10, y el sistema TXTL ha sido ya utilizado con éxito para llevar a cabo una serie de tareas bioquímicas complejas: por ejemplo, la Asamblea de bacteriófagos funcional a través de expresión sin células el genoma phage del11, la síntesis de proteína bacteriana filamentos12o la aplicación del gen sin células circuitos13,14.
Otro sistema popular en biología sintética libre de células es el sistema puro, que se reconstituye a partir de componentes purificados15,16. En comparación con el sistema TXTL, no contiene las nucleasas o maquinaria de degradación de proteínas. Mientras que la degradación de ADN lineal, las moléculas de ARN o proteínas es tan importante en el sistema puro, vías de decaimiento son realmente importantes para la implementación de funciones dinámicas. Para reducir el efecto de la degradación de la exonucleasa de plantillas gene lineal en el sistema TXTL (a través de RecBCD), la proteína extremo-protección de GamS debe agregar. El sistema puro y el TXTL están disponibles en el mercado.
Un tema estrechamente relacionado con preocupaciones de la biología celular gratis el estudio del efecto de la compartimentalización en reacciones bioquímicas y aún más la creación de estructuras de la célula artificiales o protocélulas17,18,19 ,20. Investigación sobre las células artificiales típicamente implica el encapsulamiento de un sistema de reacción bioquímica dentro de compartimientos vesiculares de fosfolípidos u otros Anfífilos. Mientras que estos sistemas ayudan a explorar aspectos fundamentales de la compartimentalización, o la aparición de la celularidad y estructuras auto-replicantes, afrontan los problemas típicos de los sistemas cerrados: en ausencia de un metabolismo funcional y apropiado mecanismos de transporte de membrana, es muy difícil mantener reacciones compartimentadas para largos períodos de tiempo – las moléculas del combustible se utilizan para arriba y se acumulan productos de desecho.
Una alternativa interesante a la compartimentación interior de dichos compartimientos imitan a las células es la organización espacial del material genético mediante métodos photolithographic. Inmovilización de “genes en un chip” fue promovido por el grupo Bar-Ziv en el Instituto Weizmann hace más de diez años21. Entre las principales cuestiones que tenían que resolver eran la adsorción inespecífica del ADN y la posible desnaturalización de proteínas en la superficie del chip. Bar-Ziv et al desarrolló una resistencia Fotolitografía dedicado llamado “Daisy”, que se compone de un silano reactivo terminal para la inmovilización de las moléculas de resistir en las superficies de dióxido de silicio, un espaciador largo polietileno glicol (PEG) que aseguró biocompatibilidad y una headgroup photocleavable, que fue convertida en una amina reactiva a la irradiación con luz ultravioleta (UV). Se ha demostrado que la Margarita puede utilizarse para inmovilizar moléculas de la DNA del gene-longitud (con longitudes de varios kilo-pares de bases (kbp)) sobre una superficie de viruta. De un polímero física punto de vista, los sistemas representan cepillos de polímero injertados sobre un sustrato sólido. Debido a la naturaleza de polielectrolito de ADN, la conformación de estos cepillos es afectada fuertemente por efectos de iones específicos osmótico y otros22,23.
Lo más importante, se ha demostrado que genes inmovilizada de sustrato son aún funcionales y pueden ser transcrito y traducido en ARN y proteínas. Cepillos de gene son accesibles para ARN Polimerasas de solución24, y la mezcla macromolecular complejo de la transcripción y traducción no es desnaturalizada en la superficie. Una de las ventajas de la inmovilización de componentes genéticos en un sustrato es que pueden funcionar en un sistema de reactor abierto microfluídico que continuamente se suministra con moléculas pequeñas precursor y de la cuales productos de desecho puede ser eliminado25 , 26.
Recientemente hemos desarrollado una variante de este método llamado Bephore (para haz de electrones Biocompatible y fotoresistencia)27, que se basó exclusivamente en los componentes comercialmente disponibles y utilizados secuencia específica DNA filamento invasión las reacciones para la realización de un procedimiento de litografía varios pasos simples de implementar para la creación de células artificiales basadas en el chip. Un Resumen esquemático del procedimiento se muestra en la figura 1. Se basa en horquilla las moléculas de ADN que contiene un grupo photocleavable, que están inmovilizadas en una capa biocompatible de PEG. Fotorrotura de la horquilla expone una secuencia de cadena simple punto de apoyo, a través de que DNA moléculas de interés (que contiene la secuencia DIS “desplazar”) pueden ser conectado vía invasión de filamento mediada por punto de apoyo.
Mientras que Bephore es potencialmente más fácil de implementar, Daisy permite la realización de muy denso y limpio “cepillos de gen”, que tiene ventajas en ciertas aplicaciones. En principio, sin embargo, litografía Daisy y Bephore podría ser fácilmente combinada. Un método de litografía relacionada utilizando desplazamiento de hebra de ADN para estructurar ADN cepillos en oro fue previamente desarrollado por Huang et al., pero no fue utilizado en el contexto del gen libre expresión28,29.
En el siguiente protocolo brindamos que una descripción detallada de la producción de ADN cepillos para la expresión del gen libre utilizando el método de Bephore. Describimos cómo el gene se fabrican y demostrar el uso de multi-step foto-litografía para la inmovilización espacialmente estructurado de genes en un chip. También discutimos la fabricación de cámaras de reacción y la aplicación de la microfluídica para la realización de reacciones de expresión del gen de la en-viruta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bephore litografía es una técnica robusta y versátil para el modelado inmovilización de ADN o ARN. Sin embargo, el procedimiento incluye varios pasos, que – si – pueden ser una fuente de fracaso o menor rendimiento del sistema.
Un paso crucial en la fabricación de chips de Bephore es la pegilación del sustrato, que proporciona la biocompatibilidad de la superficie. Aquí, el paso de limpieza con un procedimiento RCA es importante, ya que también activa la superficie para la silanizació…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo financiero para este proyecto por la Volkswagen Stiftung (grant no. 89 883) y el Consejo Europeo de investigación (beca Convenio Nº 694410 – AEDNA). M.S.-S. agradece apoyo por el DFG a través de GRK 2062.
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
References
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