Функциональные поверхности иммобилизация генов с использованием многоэтапных Strand перемещения литография
Summary
Мы опишем простой литографических процедуры для иммобилизации молекул ДНК гена длина на поверхности, которая может использоваться для выполнения экспериментов выражение гена свободных клеток на биочипов.
Abstract
Обездвиживание генов на lithographically структурированных поверхностей позволяет исследование разобщенным ген выражение процессов в системе открытого microfluidic биореактора. В отличие от других подходов к искусственным сотовых систем такая установка позволяет для бесперебойного снабжения с ген выражение реагентов и одновременного слива отходов. Это облегчает осуществление процессов выражение гена свободных клеток более продолжительных периодов времени, что имеет важное значение для реализации систем регулирования обратной связи динамического гена. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изготовления генетических биочипов, с использованием simple-to-use литографические техники на основе ДНК пряди перемещения реакций, который использует исключительно коммерчески доступных компонентов. Мы также предоставляем протокол по вопросам интеграции разобщенным генов с полиэфиром (PDMS)-на основе microfluidic системы. Кроме того мы показываем, что система совместима с микроскопии флуоресцирования (TIRF) полного внутреннего отражения, который может быть использован для прямого наблюдения молекулярных взаимодействий между ДНК и молекул, содержащихся в наборе выражений.
Introduction
Ячейки свободной экспрессии генов, которые реакции представляют большой интерес для различных применений в синтетической биологии, биохимии и биотехнологии. Ячейки свободный экспрессию белков сыграл для подготовки образцов чистого белка, которые были основой для многочисленных исследований в структурной биологии. Например клетки бесплатные системы успешно использовались для выражения протеина комплексы1 или мембранные белки2, которые трудны для того производить с помощью выражения на основе ячеек. В частности клетки бесплатно экспрессии генов, реакции также использовались для уточнения структуры генетического кода, начиная с новаторским эксперименты Ниренберг и Matthaei в 1961 году3.
Недавно наблюдается возрождение интереса к свободной ячейки методы в области биотехнологии и синтетической биологии4,5,6. Ячейки свободной системы могут быть дополнены-биологических соединений, и компоненты различных биологического происхождения могут быть объединены более легко7. Несмотря на то, что клетки свободной системы имеют явный недостаток, что они не «расти и делиться», это мыслимо подготовить открытых свободных клеток биореакторах с основные метаболические функции и пусть синтезировать метаболитов при наличии простой углерода и энергии 8входов. В рамках новой области синтетической биологии клетки-систем обещают быть более предсказуемым» шасси» для осуществления синтетических биологических функций.
В настоящее время свободных клеток ген выражение реакции осуществляется либо с помощью клеток экстрактов (из различных источников, таких как бактерии, дрожжи, насекомых), или транскрипция/перевод систем, которые были оптимизированы для различных приложений (например, прокариот против эукариотической экспрессии генов, производство мембранных белков и т.д.). Популярный протокол для подготовки бактериальной клетке экстракт (обычно называют TXTL) был недавно представленной V. Noireaux и coworkers9. Биофизические свойства были тщательно характеризуется10, и TXTL система уже успешно используется для выполнения ряда сложных биохимических задач: например, Ассамблея функциональных бактериофагов через клетки бесплатно выражение генома Фаговые11, синтеза бактериального белка нитей12или осуществление свободных клеток гена цепей13,14.
Другой системы популярны в свободной ячейке синтетической биологии является чистая система, которая воссоздается из очищенных компонентов,1516. По сравнению с TXTL системы, он не содержит nucleases или механизм деградации белков. При деградации линейной ДНК молекулы РНК и белки меньше вопроса в чистой системе, распад пути действительно важны для реализации динамических функций. Для того, чтобы уменьшить влияние деградации при exonuclease линейной гена шаблонов в системе TXTL (через RecBCD), белок GamS конце защита должна быть добавлена. TXTL и чистая система коммерчески доступны.
Тема тесно связана с проблем биологии клетки Бесплатные Изучение эффекта дробления на биохимических реакций и далее создание искусственных клеток подобных структур или protocells17,18,19 ,20. Исследования на искусственные клетки обычно включает инкапсуляцию биохимические реакции системы внутри везикулярного отсеков, сделанные из фосфолипидов или других amphiphiles. Хотя такие системы помогают исследовать фундаментальные аспекты дробления, или возникновение клеточности и самовоспроизводящаяся структур, они сталкиваются типичные проблемы замкнутых систем: в отсутствие функционирующего метаболизма и соответствующие мембранных транспортных механизмов, трудно держать разобщенным реакции для длительных периодов времени – молекулы топлива используются и накопления отходов.
Интересной альтернативой раздробленности внутри таких отделений, подражая клеток является пространственной организации генетического материала, офсетным способами. Иммобилизация «генов на чипе» был впервые предложен бар-Зив группы в институте Вейцмана более десяти лет назад21. Среди основных вопросов, которые должны быть решены были неспецифической адсорбционной ДНК и потенциальных денатурация белков на поверхности чипа. Бар-Зив et al. разработали выделенный фотолитографии сопротивляться, называют «Маргаритка», который состоит из реактивной терминала силана для иммобилизации противостоять молекул на поверхности кремния диоксид, длинные полиэтиленгликоля (PEG) разделителя, который заверил биосовместимость и photocleavable headgroup, который был преобразован в реактивной Амин после облучения с ультрафиолетового (УФ) света. Было показано, что Дейзи может использоваться для иммобилизации молекул ДНК гена Длина (с длиной несколько Кило-пар оснований (kbp)) на поверхности чипа. С точки зрения физики полимеров полимерные щетки, привитые на твердом субстрате представлены системы. Из-за характера полиэлектролит ДНК конформация этих кистей сильно зависит от осмотического и другие Ион специфические эффекты22,23.
Самое главное было показано, что субстрат прикол генов по-прежнему функционирует и могут быть расшифрованы и переведен на РНК и белка. Джин кисти доступны для РНК полимеразы решение24, и комплекс макромолекулярных смесь транскрипция/перевод не денатурировано на поверхности. Одним из преимуществ иммобилизации генетических компонентов на подложке является, что они могут эксплуатироваться в открытой microfluidic реакторная система, которая постоянно поставляется с небольшой прекурсоров молекулы и от которых отходы могут быть удалены25 , 26.
Мы недавно разработали вариант этот метод называется Bephore (для биосовместимых электронно лучевые и фоторезиста)27, которое было основано исключительно на коммерчески доступных компонентов и использовать специфичные для последовательности ДНК пряди вторжения реакции для Реализация простой в реализации многоступенчатое литографии процедуры для создания на основе чипа искусственные клетки. Схематический обзор процедуры показан на рисунке 1. Он основан на молекулы ДНК шпильки, содержащие photocleavable группу, которые иммобилизованных на слое биосовместимых КОЛЫШЕК. Photocleavage шпилька предоставляет последовательность одноцепочечной зацепки, через который ДНК молекул интерес (содержащие последовательности «вытеснения» DIS) может быть прилагаемый через зацепки опосредованной стренги вторжения.
В то время как Bephore является потенциально проще реализовать, Дейзи позволяет реализации очень густой и чистой «ген кисти», которые имеет преимущества в некоторых приложениях. В принципе однако, Дейзи и Bephore литография может легко сочетаться. Связанной с литографией метод использования которых перемещение нити ДНК для структурирования ДНК щетки на золото был ранее разработан Хуан et al., но не был использован в контексте свободных клеток ген выражение28,29.
В следующий протокол мы предоставляем подробное описание производства ДНК щетки для экспрессии генов клеток бесплатно, с помощью метода Bephore. Мы описываем, как ген фишки изготовлены и демонстрируют использование многоступенчатой фото литография пространственно структурированных иммобилизации генов на чипе. Мы также обсуждаем изготовление реакции камер и применение микрофлюидика для проведения реакций выражение гена на чипе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Литография Bephore — это надёжный и универсальный метод для узорной иммобилизации ДНК или РНК. Тем не менее процедура включает несколько этапов, которые – если изменено – может быть источником для отказа или снижению производительности системы.
Решающим шагом в изготовлени?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы с благодарностью признаем финансовую поддержку для этого проекта Volkswagen Stiftung (Грант № 89 883) и Советом европейских исследований (Грант соглашение № 694410 – AEDNA). М.С. S. признает поддержки DFG через ГРК 2062.
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
References
- Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
- Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins – a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
- Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
- Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
- Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
- Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
- Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
- van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
- Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
- Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
- Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
- Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
- Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
- Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
- Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
- Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
