Superficie-immobilizzazione funzionale dei geni usando Multistep Strand Displacement Litografia
Summary
Descriviamo una semplice procedura litografica per l’immobilizzazione di molecole di DNA del gene-lunghezza su una superficie, che può essere utilizzata per eseguire gli esperimenti di espressione del gene senza cellula il biochip.
Abstract
Immobilizzazione dei geni su superfici litograficamente strutturate permette lo studio del gene compartimenti processi di espressione in un sistema di bioreattore microfluidico aperta. A differenza di altri approcci verso sistemi cellulari artificiali, tale configurazione consente un approvvigionamento continuo con reagenti di espressione genica e simultanea di scarico dei prodotti di scarto. Questo facilita l’implementazione di processi di espressione genica senza cellula per lunghi periodi di tempo, che è importante per la realizzazione di sistemi di regolamentazione feedback dinamico gene. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la realizzazione di biochip genetica usando una tecnica litografica di simple-to-use basata su reazioni di spostamento del filo del DNA, che utilizza esclusivamente i componenti disponibili in commercio. Forniamo anche un protocollo sull’integrazione dei compartimenti geni con un polidimetilsilossano (PDMS)-basato su sistema microfluidico. Inoltre, indichiamo che il sistema è compatibile con microscopia di fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale, che può essere utilizzata per l’osservazione diretta delle interazioni molecolari tra DNA e molecole contenute nel mix di espressione.
Introduction
Cella-libera espressione genica reazioni sono di grande interesse per varie applicazioni in biochimica, delle biotecnologie e biologia sintetica. Senza cellula di espressione delle proteine è stato determinante per la preparazione di campioni di proteine pure, che erano alla base di numerosi studi in biologia strutturale. Per esempio, sistemi senza cellula sono stati utilizzati con successo per l’espressione della proteina complessi1 o membrana proteine2, che sono difficili da produrre utilizzando espressione basati su cellule. In particolare, senza cellula reazioni erano usate anche per delucidare la struttura del codice genetico, a partire con gli esperimenti innovativi di Nirenberg e Matthaei nel 19613l’espressione genica.
Recentemente, c’è stato un rinnovato interesse nei metodi senza cellula in biotecnologie e biologia sintetica4,5,6. Sistemi senza cellula possono essere ampliate con composti non-biologico, e componenti di origine biologica, diversa possono essere combinati più facilmente7. Anche se sistemi senza cellula hanno lo svantaggio evidente che essi non “crescono e si dividono”, è concepibile per preparare aperte senza cellula bioreattori con funzioni metaboliche di base e lasciarli a sintetizzare metaboliti quando dotati di energia e di carbonio semplice ingressi8. All’interno del campo emergente della biologia sintetica, sistemi senza cellula promettono di essere un “telaio” più prevedibile per l’attuazione delle funzioni biologiche sintetici.
Attualmente, le reazioni di espressione genica senza cellula sono effettuate utilizzando estratti cellulari (da diverse fonti quali batteri, lieviti, insetti), o sistemi di trascrizione/traduzione che sono stati ottimizzati per diverse applicazioni (ad es., procariotiche vs eucariotiche espressione genica, produzione di proteine di membrana, ecc.). Un popolare protocollo per la preparazione dell’estratto di cellula batterica (comunemente chiamato TXTL) è stato fornito recentemente da V. Noireaux e colleghe9. Sue proprietà biofisiche sono stati accuratamente caratterizzata10, e il sistema TXTL è stato già utilizzato con successo per eseguire una serie di complesse attività biochimiche: ad esempio, l’Assemblea dei batteriofagi funzionale tramite senza cellula espressione del genoma dei fagi11, la sintesi di proteina batterica filamenti12o l’attuazione del gene senza cellula circuiti13,14.
Un altro sistema popolare in biologia senza cellula sintetica è il sistema puro, che viene ricostituito da componenti purificate15,16. Rispetto al sistema TXTL, non contiene nucleasi o macchine di degradazione della proteina. Durante la degradazione di DNA lineare, molecole del RNA o proteine è meno di un problema nel sistema puro, vie di decadimento sono in realtà importante per l’implementazione di funzioni dinamiche. Al fine di ridurre l’effetto di degradazione di exonuclease di modelli lineari genica nel sistema TXTL (attraverso RecBCD), la proteina di GamS fine-protezione dovrà essere aggiunto. Sia il TXTL e il sistema puro sono disponibili in commercio.
Un argomento strettamente legato alle preoccupazioni senza cellula biologia lo studio dell’effetto di compartimentalizzazione su reazioni biochimiche e ulteriormente la creazione di strutture alveolari artificiali o protocellule17,18,19 ,20. Ricerca sulle cellule artificiali in genere implica l’incapsulamento di un sistema di reazione biochimica all’interno di compartimenti vescicolari effettuata in fosfolipidi o altri anfifili. Mentre tali sistemi aiutano a esplorare gli aspetti fondamentali della compartimentalizzazione, o la comparsa di cellularità e strutture auto-replicanti, si trovano ad affrontare le problematiche tipiche di sistemi chiusi: in assenza di un metabolismo funziona e appropriato meccanismi di trasporto di membrana, è difficile mantenere reazioni compartimenti in esecuzione per lunghi periodi di tempo – molecole di carburante vengono utilizzati e prodotti di scarto si accumulano.
Un’interessante alternativa alla compartimentazione all’interno di tali compartimenti che imita cella è l’organizzazione spaziale di materiale genetico mediante metodi fotolitografiche. Immobilizzazione dei “geni su un chip” è stato lanciato dal gruppo Bar-Ziv presso l’Istituto di Weizmann più di dieci anni fa21. Tra le principali questioni che dovevano essere risolti erano l’adsorbimento non specifico del DNA e la potenziale denaturazione delle proteine sulla superficie del chip. Bar-Ziv et al ha sviluppato un resist fotolitografia dedicato chiamato “Daisy”, che era composta di un silano terminale reattivo per l’immobilizzazione delle molecole resistere sulle superfici di biossido di silicio, un distanziatore lungo polietilenglicole (PEG) che ha assicurato biocompatibilità e capigruppo un photocleavable, che è stato convertito in un’ammina reattiva all’irradiazione con luce ultravioletta (UV). È stato dimostrato che Daisy può essere utilizzato per immobilizzare molecole di DNA del gene-lunghezza (con lunghezze diverse kilo-di coppie di basi (kbp)) su una superficie del chip. Da un punto di vista della fisica di polimeri, i sistemi rappresentati spazzole polimero innestati su un substrato solido. A causa della natura di polielettrolita del DNA, la conformazione di queste spazzole è fortemente influenzata dalla osmotico e altri effetti di ioni specifici22,23.
La cosa più importante, ha dimostrato che geni immobilizzati substrato sono ancora funzionali e possono essere trascritto e tradotto in RNA e proteina. Gene pennelli sono accessibili per la polimerasi del RNA dalla soluzione24, e il complesso composto macromolecolare della trascrizione/traduzione non è denaturato alla superficie. Uno dei vantaggi di immobilizzazione dei componenti genetiche su un substrato è che essi possano funzionare in un sistema di reattore aperto microfluidici che continuamente viene fornito con molecole precursori piccolo e da quali prodotti di scarto può essere rimosso25 , 26.
Recentemente abbiamo sviluppato una variante di questo metodo chiamato Bephore (per fascio di elettroni biocompatibile e photoresist)27, che era basato esclusivamente su componenti disponibili in commercio e utilizzati reazioni di invasione di strand DNA sequenza-specifiche per la realizzazione di una procedura di Litografia multistep semplice da implementare per la creazione di cellule artificiali basati su chip. Una descrizione schematica della procedura è illustrata nella Figura 1. È basato su molecole di DNA tornante contenente un gruppo di photocleavable, che sono immobilizzati su un livello di PEG biocompatibile. Photocleavage dei tornanti espone una sequenza di filamento singolo punto d’appoggio, attraverso il quale DNA molecole di interesse (contenente la sequenza DIS “spostando”) possono essere collegato via invasione strand toehold-mediata.
Mentre Bephore è potenzialmente più semplice da implementare, Daisy permette la realizzazione di molto denso e pulito “spazzole del gene”, che presenta vantaggi in determinate applicazioni. In linea di principio, tuttavia, Litografia Daisy e Bephore potrebbe essere facilmente combinato. Un metodo di Litografia correlata utilizzando spazzole di DNA strand displacement per strutturazione del DNA su oro precedentemente è stato sviluppato da Huang et al., ma non è stata utilizzata nel contesto dell’espressione genica senza cellula28,29.
Il seguente protocollo forniamo che una descrizione dettagliata della produzione di DNA pennelli per l’espressione genica senza cellula utilizzando il metodo Bephore. Descriviamo come il chip del gene sono fabbricati e dimostrare l’uso di multi-step foto-litografia per l’immobilizzazione spazialmente strutturato dei geni su un chip. Inoltre discutiamo la realizzazione di camere di reazione e l’applicazione della microfluidica per lo svolgimento delle reazioni di espressione genica su chip.
Protocol
Representative Results
Discussion
Litografia di Bephore è una tecnica robusta e versatile per l’immobilizzazione con motivi di DNA o RNA. Ancora, la procedura prevede diversi passaggi, che – se cambiato – possono essere una fonte per guasto o riduzione delle prestazioni del sistema.
Un passo cruciale nella fabbricazione di circuiti integrati Bephore è la PEGilazione del substrato, che fornisce la biocompatibilità della superficie. Qui, la fase di pulizia con una procedura RCA è importante, poiché attiva anche la superfici…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario per questo progetto la Volkswagen Stiftung (grant No. 89 883) e il Consiglio europeo della ricerca (concessione contratto n. 694410 – AEDNA). M.S.-S. riconosce il sostegno dal DFG attraverso GRK 2062.
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
References
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