Surface-immobilisation fonctionnelle des gènes à l’aide de la lithographie de déplacement multipas Strand
Summary
Nous décrivons une procédure simple lithographique pour l’immobilisation des molécules d’ADN gène-longueur sur une surface, ce qui peut être utilisée pour réaliser des expériences d’expression de gène acellulaire sur biopuces.
Abstract
Immobilisation des gènes sur les surfaces lithographically structurés permet l’étude du gène compartimentée processus d’expression dans un système de bioréacteur microfluidique ouvert. Contrairement aux autres approches vers des systèmes cellulaires artificielles, une telle installation permet un approvisionnement continu avec les réactifs d’expression de gène et simultanée, l’évacuation de déchets produits. Cela facilite la mise en œuvre des processus d’expression de gène acellulaire sur de longues périodes de temps, ce qui est important pour la réalisation de systèmes de rétroaction réglementaire de gène dynamique. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la fabrication de biopuces génétiques en utilisant une technique lithographique de simple-to-use issue des réactions de déplacement de brin de l’ADN, qui utilise exclusivement des composants disponibles dans le commerce. Nous fournissons également un protocole sur l’intégration des gènes compartimentées avec un polydiméthylsiloxane (PDMS)-basé système microfluidique. De plus, nous montrons que le système est compatible avec la microscopie de fluorescence (FRBR) de réflexion totale interne, qui peut être utilisée pour l’observation directe des interactions moléculaires entre l’ADN et les molécules contenues dans le mélange d’expression.
Introduction
Les réactions sont d’un grand intérêt pour diverses applications en biochimie, biotechnologie, biologie synthétique et l’expression des gènes sans cellule. Acellulaire expression de protéines a contribué à la préparation des échantillons de protéines pures, qui faisaient l’objet de nombreuses études en biologie structurale. Par exemple, des systèmes acellulaires ont été utilisés avec succès pour l’expression des protéines complexes1 ou membrane protéines2, qui sont difficiles à produire en utilisant expression basés sur les cellules. Notamment, acellulaire réactions ont également été utilisées pour élucider la structure du code génétique, commençant par les expériences révolutionnaires par Nirenberg et Matthaei en 19613l’expression des gènes.
Récemment, il y a eu un regain d’intérêt pour les méthodes acellulaire en biotechnologie et biologie synthétique4,5,6. Des systèmes acellulaires peuvent être augmentés avec les composés non biologiques, et des composants de diverses origines biologiques peuvent être combinés plus facilement7. Même si des systèmes acellulaires ont l’inconvénient évident qu’ils ne sont pas « cultiver et diviser », il est concevable de préparer ouverts acellulaire bioréacteurs avec fonctions métaboliques de base et leur faire synthétiser des métabolites lorsqu’il est fourni avec l’énergie et de carbone simple entrées8. Dans le domaine émergent de la biologie synthétique, systèmes acellulaires promettent d’être un « châssis » plus prévisible pour la mise en œuvre des fonctions biologiques synthétiques.
Actuellement, les réactions d’expression de gène acellulaires sont effectuées soit à l’aide des extraits cellulaires (à partir de différentes sources telles que les bactéries, les levures, les insectes), ou qui ont été optimisés pour différentes applications (p. ex., des systèmes de transcription/traduction procaryotes et eucaryotes expression génique, production de protéines membranaires, etc.). Un protocole populaire pour la préparation d’extrait de cellule bactérienne (communément appelé TXTL) a été fourni récemment par V. Noireaux et collaborateurs9. Ses propriétés biophysiques ont été soigneusement caractérisés10, et le système TXTL a été déjà utilisé avec succès pour effectuer une série de tâches biochimiques complexes : par exemple, l’Assemblée des bactériophages fonctionnelle via acellulaire expression du génome phagique11, la synthèse des protéines bactériennes filaments12ou la mise en œuvre du gène acellulaire circuits13,14.
Un autre système populaire en biologie synthétique acellulaire est le pur, qui est reconstituée à partir des composantes purifiées15,16. Par rapport au système TXTL, il ne contient pas de nucléases ou mécanisme de dégradation des protéines. Alors que la dégradation de l’ADN linéaire, molécules d’ARN ou de protéines est moins un problème dans le système pur, voies de décomposition sont réellement importants pour la mise en œuvre des fonctions dynamiques. Afin de réduire l’effet de la dégradation de l’exonucléase de modèles linéaires de gène dans le système TXTL (par RecBCD), la protéine de GamS-protection de fin doit être ajouté. Le TXTL tant le système pur sont disponibles dans le commerce.
Un sujet étroitement lié aux préoccupations acellulaire biologie l’étude de l’effet de cloisonnement sur les réactions biochimiques et outre la création de structures artificielles de cellules ou protocells17,18,19 ,,20. Recherche sur les cellules artificielles implique généralement l’encapsulation d’un système de réaction biochimique à l’intérieur des compartiments vésiculaires de phospholipides ou autres amphiphiles. Tandis que ces systèmes aident à explorer les aspects fondamentaux de la compartimentation, ou l’émergence de la cellularité et structures auto-réplication, ils font face à des problèmes typiques des systèmes fermés : en l’absence d’un métabolisme efficace et approprié mécanismes de transport de membrane, il est difficile de garder des réactions compartimentées en cours d’exécution pendant de longues périodes de temps – molécules de carburant ont été utilisés et les déchets s’accumulent.
Une alternative intéressante à la compartimentation à l’intérieur de ces compartiments cellulaires-imitant est l’organisation spatiale du matériel génétique à l’aide de méthodes photolithographiques. Immobilisation des « gènes sur une puce » a été lancée par le groupe Bar-Ziv à l’Institut Weizmann, il y a plus de dix ans21. Parmi les grandes questions qui devaient être résolues ont été l’adsorption non spécifique de l’ADN et l’éventuelle dénaturation des protéines à la surface de la puce. Bar-Ziv et coll. a développé une résistance photolithographie dédiée appelée « Daisy », qui était composé d’un silane terminal réactif pour l’immobilisation des molécules sur les surfaces de dioxyde de silicium, résister à un intercalaire longue de polyéthylèneglycol (PEG) qui a assuré biocompatibilité et une tête de PHOTOCLIVABLES, qui a été transformé en une amine réactive lors de l’irradiation avec la lumière ultraviolette (UV). Il a été démontré que Daisy peut être utilisé pour immobiliser les molécules d’ADN gène-longueur (avec des longueurs de plusieurs kilo paires de bases (KPB)) sur une surface de puce. D’un point de vue de polymère physique, les systèmes représentant brosses polymère greffés sur un substrat solide. En raison de la nature de polyélectrolyte de l’ADN, la conformation de ces brosses est fortement affectée par osmotique et autres effets spécifiques à ion22,23.
Surtout, il a été démontré que substrat immobilisée gènes sont encore fonctionnels et peuvent être transcrit et traduit en ARN et des protéines. Brosses de gène sont accessibles pour les ARN polymérases de solution24, et le mélange complexe macromoléculaire de la transcription/traduction n’est pas dénaturé à la surface. Un des avantages de l’immobilisation des composantes génétiques sur un substrat est qu’ils peuvent être utilisés dans un système de réacteur ouvert microfluidique qui est fourni en continu avec des molécules précurseurs de petite et de quels produits de déchets peut être enlevé25 , 26.
Nous avons récemment mis au point une variante de cette méthode, appelée Bephore (par faisceau d’électrons Biocompatible et résine photosensible)27, qui reposait exclusivement sur les composants disponibles dans le commerce et utilisé des réactions spécifiques séquence ADN brin invasion pour la réalisation d’une procédure de simple-to-implement Lithographie plusieurs étapes pour la création de cellules artificielles à base de puce. Un aperçu schématique de la procédure est illustré à la Figure 1. Il est issu des molécules d’épingle à cheveux ADN contenant un groupe PHOTOCLIVABLES, qui sont immobilisées sur une couche de PEG biocompatible. Photoclivage de l’épingle expose une séquence simple brin pied, à travers lequel l’ADN molécules d’intérêt (qui contient la séquence DIS « DEPLACEMENT ») peuvent être jointe par l’invasion brin induite par le pied.
Alors que Bephore est potentiellement plus simple à mettre en œuvre, Daisy permet la réalisation de très dense et très propre « brosses à gène », qui a des avantages dans certaines applications. En principe, cependant, lithographie de Daisy et Bephore pourrait être facilement combiné. Une méthode connexe Lithographie utilisant déplacement brin ADN pour structurer les ADN brosses sur l’or a été précédemment développé par Huang et al., mais n’était pas utilisé dans le cadre d’expression de gène acellulaire28,29.
Dans le protocole suivant, nous fournir qu’une description détaillée de la production d’ADN brushes pour l’expression des gènes sans cellule à l’aide de la méthode Bephore. Les auteurs décrivent comment les puces sont fabriqués et démontrent l’utilisation de plusieurs étape photo-Lithographie pour l’immobilisation structurée spatialement de gènes sur une puce. Nous discutons également la fabrication des chambres de réaction et l’application de microfluidique pour l’exécution des réactions d’expression génique sur puce.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bephore lithographie est une technique robuste et polyvalente pour l’immobilisation à motifs d’ADN ou d’ARN. Pourtant, la procédure comprend plusieurs étapes, ce qui – si changé – peuvent être une source de l’échec ou réduit les performances du système.
Une étape cruciale dans la fabrication de puces de Bephore est la PEGylation du substrat, qui fournit la biocompatibilité de la surface. Ici, l’étape de nettoyage avec une procédure RCA est important, car il active égalem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le soutien financier à ce projet par la Fondation Volkswagen (subvention no 89 883) et l’European Research Council (subvention contrat n° 694410 – AEDNA). M.S.-S. reconnaît la prise en charge par la DFG par GRK 2062.
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
References
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