多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化
Summary
面上、バイオチップの無細胞遺伝子発現実験を行うため遺伝子長 DNA 分子の固定化のための単純な石版プロシージャについて述べる。
Abstract
パターニング構造表面の遺伝子の固定化は、オープン マイクロ バイオリアクターで仕切られた遺伝子の研究の表現プロセスを許可します。人工のセルラ システムへの他のアプローチと対照をなしてこのようなセットアップを可能遺伝子式試薬と同時排出廃棄物の連続的な供給に。動的遺伝子制御フィード バック システムの実現のために重要である時間の長時間にわたって無細胞遺伝子発現プロセスの実装が容易になります。ここを用いたシンプルな使い平版 DNA ストランド変位反応に基づく市販コンポーネントを排他的に使用する遺伝のバイオチップの作製のための詳しいプロトコルを提供します。我々 もポリジメチルシロキサン (PDMS) で仕切られた遺伝子の統合のプロトコルを提供-を用いたマイクロ流体システム。さらに、システムが DNA と式ミックスに含まれている分子の分子間相互作用の直接観察に使用することができます内部全反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡と互換性があることを示します。
Introduction
無細胞発現反応様々 なアプリケーションのための生化学、バイオ テクノロジー、合成生物学で注目されています。無細胞タンパク質発現は、純粋な蛋白質のサンプルは、多くの研究のための基礎は、構造生物学の準備のため尽力しました。例えば、無細胞システム正常に使用された蛋白質複合体1または膜蛋白質2の式のセル ベースの式を使用して生成することは困難であります。特に、無細胞遺伝子発現反応は 1961年3ニーレンバーグとマッセイによる画期的な実験から始まる遺伝コードの構造の解明にも使われました。
最近では、バイオ テクノロジー、合成生物学4,5,6セル自由な方法で新たな関心がずっとあります。非生物学的化合物と無細胞システムを拡張できより簡単に7多様な生物学的起源のコンポーネントを組み合わせることができます。それは基本的な代謝機能を持つオープン携帯無料バイオリアクターを準備し、ときに単純な炭素とエネルギーの代謝産物を合成させて考えられるにもかかわらず無細胞システムがある明らかにそうでない「成長し、分裂」不利、入力8。合成生物学の新たな分野で無細胞システムは、合成生物学的機能の実装をより予測可能な「シャーシ」をすることを約束します。
現在、無細胞遺伝子発現反応いずれかを使用して実行されます (細菌、酵母、昆虫などさまざまなソース) から細胞を抽出または転写/翻訳システム (例えば、異なるアプリケーション用に最適化されました。原核生物と真核生物遺伝子発現、膜タンパク質等の生産)。(TXTL とも呼ばれる) の細菌の細胞抽出液の準備のための一般的なプロトコルは、V. Noireaux と同僚の9によって最近提供されました。生物物理プロパティは徹底的に特徴づけられる10をされているし、TXTL システムはすでに使用されて正常に一連の複雑な生化学的なタスクを実行する:などの機能的なバクテリオファージを介してアセンブリバクテリオファージのゲノム11、細菌のタンパク質フィラメント12の合成または無細胞遺伝子回路13,14の実装の無細胞式。
無細胞合成生物学で人気のある別のシステムは、浄化されたコンポーネント15,16から再構成した純粋のシステムです。TXTL システムと比較して、それは核酸やタンパク質分解機械を含まれません。線形 DNA の分解中、rna または蛋白質、問題の少ない純粋なシステム崩壊経路が動的な関数の実装のために実際に重要です。(RecBCD) による TXTL システムの線形遺伝子テンプレート exonuclease 劣化の影響を減らすために Gam の終わりを保護するタンパク質は追加しなければなりません。TXTL、純粋なシステムが購入できます。
生化学的な反作用の区画化の効果と人工細胞のような構造や吹き込む17,18,19 の更なる創造の研究が細胞生物学の問題に話題が密接に関連 ,20。人工細胞研究は通常リン脂質や他の両親媒性物質から作られた小胞のコンパートメント内の生化学的反応システムのカプセル化を行います。このようなシステムは、区画の基本的な側面や細胞性と自己複製の構造の出現を探索するため、クローズド システムの典型的な問題に直面彼ら: 機能代謝と適切な不在で膜輸送機構、それが時間の長時間実行されている区分の反応を維持することは困難 – 燃料分子使用し、廃棄物を蓄積します。
このようなセルを模倣したコンパートメント内の区画に興味深い代替はフォトリソグラフィー メソッドを使用して遺伝物質の空間的組織です。「チップ上の遺伝子」の固定化は 10 年以上前のワイツマン研究所のバー Ziv グループによって開拓された21。解決する持っていた主要な問題の中でチップの表面蛋白質の潜在的な変性と DNA の非特異吸着をあった。バー Zivら「デイジー」は、二酸化ケイ素の表面にレジスト分子固定化保証長いポリエチレング リコール (PEG) スペーサー用反応性ターミナル シランで構成されていたと呼ばれる専用のフォトリソグラフィ レジストの開発生体適合性、および光分解性の headgroup、紫外線 (UV) 照射時に反応性アミンに変えられました。チップ表面 (数キロ塩基対 (kbp) の長さ) の遺伝子長 DNA 分子を固定するデイジーを使えることが示されています。ビューの高分子物理学の観点からは、システムは、固体基板上にグラフトした高分子ブラシを表されます。Dna 高分子電解質性質では、これらのブラシの構造は浸透圧などのイオン効果22,23に強く影響します。
最も重要なは、基板固定化遺伝子がまだ機能している、転写と翻訳の RNA および蛋白質にすることができます示されています。遺伝子ブラシはソリューション24、RNA ポリメラーゼのためアクセス、転写・翻訳の複雑な高分子混合物表面の変性していません。基板上の遺伝的要素の固定化の利点の 1 つは、彼らが小さな前駆体分子とする廃棄物は、削除された25から絶えず供給されるオープン マイクロ流体リアクター システムで動作する,26。
我々 は最近開発 (生体電子ビームのフォトレジスト) Bephore27, 市販コンポーネントに専ら基づいていた、シーケンス DNA 鎖の侵略の反応を活用と呼ばれるこのメソッドのバリエーションチップに基づく人工細胞の作成を簡単に実装できる多段階露光プロシージャの実現。手順の概要を図 1に示します。それは、生体適合性 PEG 層が固定化する光分解性グループを含んでいる DNA のヘアピンの分子に基づいています。ヘアピンの電子スピンダイナミクス興味 (「変位」DIS シーケンスを含む) の分子がストランドの足掛かりを介した侵入接続経由でをすることができますどの DNA を一本鎖足掛かりシーケンスを公開します。
デイジーが非常に密できれいなのも実現できます Bephore は潜在的に簡単に実装が、「遺伝子のブラシ」は、特定のアプリケーションの利点があります。原則として、ただし、デイジーと Bephore リソグラフィ簡単に組み合わせ。関連リソグラフィー法による DNA を構築するための DNA ストランド変位は金ブラシ黄らで以前に開発したが、無細胞遺伝子式28,29のコンテキストで未使用だった。
次のプロトコルの DNA の生産の詳細な説明は、Bephore 法を用いた無細胞発現のブラシを提供しています。遺伝子チップを試作し、チップの遺伝子の空間的構造の固定化のための多段階露光の使用方法を示す方法について述べる。反応室の作製とマイクロ流体チップで遺伝子発現反応のパフォーマンスのためのアプリケーションについても述べる。
Protocol
Representative Results
Discussion
Bephore リソグラフィは、DNA や RNA のパターンの固定化のため堅牢で汎用性の高いテクニックです。まだ、手順、- 変更 – 場合はエラーのソースをすることができるいくつかの手順が含まれています。 またはシステムのパフォーマンスが低下します。
Bephore チップの作製の重要なステップは、表面の生体適合性を提供する基板の peg 修飾操作です。ここでは、それはまたそ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は感謝してフォルクスワーゲン財団 (グラント号 89 883)、欧州研究評議会 (契約番号 694410 – AEDNA) で、このプロジェクトのための財政支援を認めます。M. S. S.GRK 2062 を通じて DFG による支援を認めています。
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
References
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