कार्यात्मक सतह-Multistep कतरा विस्थापन लिथोग्राफी का उपयोग कर जीन के स्थिरीकरण
Summary
हम एक सतह पर जीन लंबाई डीएनए अणुओं के स्थिरीकरण के लिए एक सरल lithographic प्रक्रिया का वर्णन है, जो सेल से मुक्त जीन अभिव्यक्ति प्रयोगों पर प्रदर्शन किया जा सकता है ।
Abstract
lithographically संरचित सतहों पर जीन के स्थिरीकरण एक खुले microfluidic में compartmentalized जीन अभिव्यक्ति प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है । कृत्रिम सेलुलर सिस्टम की दिशा में अंय दृष्टिकोण के विपरीत, इस तरह के एक सेटअप जीन अभिव्यक्ति रिएजेंट और अपशिष्ट उत्पादों के एक साथ draining के साथ एक सतत आपूर्ति के लिए अनुमति देता है । यह समय की विस्तारित अवधि, जो गतिशील जीन विनियामक प्रतिक्रिया प्रणाली की प्राप्ति के लिए महत्वपूर्ण है पर सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति प्रक्रियाओं के कार्यांवयन की सुविधा । यहां हम आनुवंशिक के निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए एक सरल उपयोग lithographic तकनीक का उपयोग करने के लिए डीएनए किनारा विस्थापन प्रतिक्रियाओं, जो विशेष रूप से व्यावसायिक उपलब्ध घटकों का उपयोग करता है के आधार पर चिप । हम भी एक polydimethylsiloxane (PDMS) आधारित microfluidic प्रणाली के साथ compartmentalized जीन के एकीकरण पर एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इसके अलावा, हम बताते है कि प्रणाली कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी है, जो डीएनए और अभिव्यक्ति मिश्रण में निहित अणुओं के बीच आणविक बातचीत के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ संगत है ।
Introduction
सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं जैव रसायन, बायोटेक्नोलॉजी, और सिंथेटिक जीव विज्ञान में विभिंन अनुप्रयोगों के लिए बहुत रुचि के हैं । प्रोटीन की कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति शुद्ध प्रोटीन के नमूनों की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी, जो संरचनात्मक जीवविज्ञान में कई अध्ययनों के लिए आधार थे । उदाहरण के लिए, सेल मुक्त प्रणालियों सफलतापूर्वक प्रोटीन परिसरों1 या झिल्ली प्रोटीन2, जो सेल आधारित अभिव्यक्ति का उपयोग कर उत्पादन करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं की अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया गया । विशेष रूप से, सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं को भी आनुवंशिक कोड की संरचना स्पष्ट, Nirenberg और Matthaei द्वारा groundbreaking प्रयोगों के साथ शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया गया १९६१3।
हाल ही में, वहां जैव प्रौद्योगिकी और सिंथेटिक जीवविज्ञान4,5,6में सेल मुक्त तरीकों में एक नए सिरे से ब्याज दिया गया है । सेल मुक्त प्रणालियों गैर जैविक यौगिकों के साथ संवर्धित किया जा सकता है, और विविध जैविक मूल के घटकों और अधिक आसानी से जोड़ा जा सकता है7। हालांकि सेल मुक्त प्रणालियों स्पष्ट नुकसान है कि वे “नहीं बढ़ने और विभाजन” है, यह बुनियादी चयापचय कार्यों के साथ खुले सेल मुक्त reचयापचयोंs तैयार करने के लिए कल्पना है और उंहें जब सरल कार्बन और ऊर्जा के साथ प्रदान की संश्लेषित करते है आदानों8. सिंथेटिक जीव विज्ञान के उभरते क्षेत्र के भीतर, सेल मुक्त प्रणालियों सिंथेटिक जैविक कार्यों के कार्यांवयन के लिए एक और अधिक पूर्वानुमान “चेसिस” होने का वादा ।
वर्तमान में, सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं बाहर किया जाता है या तो (जैसे बैक्टीरिया, खमीर, कीड़ों के रूप में विभिंन स्रोतों से) सेल निष्कर्षों का उपयोग कर, या प्रतिलेखन/अनुवाद प्रणाली है जो विभिंन अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित थे (जैसे, prokaryotic बनाम eukaryotic जीन अभिव्यक्ति, झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन, आदि) । बैक्टीरियल कोशिका निकालने की तैयारी के लिए एक लोकप्रिय प्रोटोकॉल (आमतौर पर अवधि TXTL) वी Noireaux और सहकर्मियों9द्वारा हाल ही में प्रदान किया गया था । इसके जैव भौतिक गुणों को अच्छी तरह से किया गया है10विशेषता है, और TXTL प्रणाली पहले से ही उपयोग किया गया है सफलतापूर्वक जटिल रासायनिक कार्यों की एक श्रृंखला करने के लिए: जैसे, कार्यात्मक bacteriophages के विधानसभा के माध्यम से फेज जीनोम के सेल मुक्त अभिव्यक्ति11, बैक्टीरियल प्रोटीन के संश्लेषण12, या सेल मुक्त जीन सर्किट के कार्यांवयन13,14।
एक अंय प्रणाली सेल में लोकप्रिय मुक्त सिंथेटिक जीवविज्ञान शुद्ध प्रणाली है, जो15,16शुद्ध घटकों से पुनर्गठन किया जाता है । TXTL प्रणाली की तुलना में, यह nucleases या प्रोटीन क्षरण मशीनरी शामिल नहीं है । जबकि रैखिक डीएनए के क्षरण, आरएनए अणु या प्रोटीन शुद्ध प्रणाली में एक मुद्दे के कम है, क्षय मार्ग गतिशील कार्यों के कार्यांवयन के लिए वास्तव में महत्वपूर्ण हैं । आदेश में TXTL प्रणाली (RecBCD के माध्यम से) में रैखिक जीन टेम्पलेट्स के exonuclease क्षरण के प्रभाव को कम करने के लिए, अंत GamS प्रोटीन की रक्षा करने के लिए जोड़ा जाना है । TXTL और शुद्ध प्रणाली दोनों ही व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ।
एक विषय बारीकी से सेल से संबंधित मुक्त जीवविज्ञान जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं पर compartmentalization के प्रभाव के अध्ययन की चिंताओं, और आगे कृत्रिम कोशिका की तरह संरचनाओं के निर्माण या protocells17,18,19 ,20. कृत्रिम कोशिकाओं पर अनुसंधान आमतौर पर फॉस्फोलिपिड या अंय amphiphiles से बने vesicular डिब्बों के अंदर एक जैव रासायनिक प्रतिक्रिया प्रणाली के encapsulation शामिल है । जबकि ऐसे सिस्टम compartmentalization, या सेलुलर और आत्म-नकल संरचनाओं के उद्भव के बुनियादी पहलुओं का पता लगाने में मदद, वे बंद प्रणालियों के विशिष्ट समस्याओं का सामना: एक कार्य चयापचय और उपयुक्त के अभाव में झिल्ली परिवहन तंत्र, यह compartmentalized प्रतिक्रियाओं समय की विस्तारित अवधि के लिए चल रहा रखने के लिए मुश्किल है-ईंधन अणुओं का उपयोग किया जाता है और अपशिष्ट उत्पादों जमा ।
इस तरह के सेल नकल उतार डिब्बों के अंदर compartmentalization के लिए एक दिलचस्प विकल्प आनुवंशिक सामग्री के स्थानिक संगठन photolithographic तरीकों का उपयोग कर रहा है । एक चिप पर “जीन के स्थिरीकरण” Weizmann संस्थान में बार-Ziv समूह द्वारा अग्रणी था और अधिक से अधिक दस साल पहले21। जिन प्रमुख मुद्दों को सुलझाया जाना था उनमें डीएनए की गैर-विशिष्ट सोखना और चिप सतह पर प्रोटीन की संभावित विकार थीं. बार-Ziv एट अल. विकसित एक समर्पित photolithography विरोध “डेज़ी”, जो सिलिकॉन डाइऑक्साइड सतहों पर प्रतिरोध अणुओं के स्थिरीकरण के लिए एक प्रतिक्रियाशील टर्मिनल silane से बना था, एक लंबी पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) स्पेसर कि आश्वासन दिया , और एक photocleavable headgroup, जो पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के साथ विकिरण पर प्रतिक्रियाशील अमीन में परिवर्तित किया गया था । यह दिखाया गया है कि डेज़ी जीन लंबाई डीएनए अणुओं (कई किलो आधार-जोड़े (kbp) की लंबाई के साथ) एक चिप सतह पर स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । देखने का एक बहुलक भौतिकी बिंदु से, सिस्टम बहुलक एक ठोस सब्सट्रेट पर भ्रष्टाचारी ब्रश का प्रतिनिधित्व किया । डीएनए के polyelectrolyte प्रकृति के कारण, इन ब्रश के अनुरूप आसमाटिक और अंय आयन विशेष प्रभाव22,23से दृढ़ता से प्रभावित है ।
सबसे महत्वपूर्ण बात, यह है कि सब्सट्रेट-मैटीरियल जीन अभी भी कार्यात्मक है और लिखित और आरएनए और प्रोटीन में अनुवाद किया जा सकता है दिखाया गया है । जीन ब्रश समाधान24से आरएनए polymerases के लिए सुलभ हैं, और प्रतिलिपि/अनुवाद के जटिल macromolecular मिश्रण सतह पर विकृत नहीं है । एक सब्सट्रेट पर आनुवंशिक घटकों के स्थिरीकरण के लाभों में से एक यह है कि वे एक खुले microfluidic रिएक्टर प्रणाली है कि लगातार छोटे अग्रदूत अणुओं और जो अपशिष्ट उत्पादों से25 हटाया जा सकता है के साथ आपूर्ति की जाती है में संचालित किया जा सकता है , 26.
हम हाल ही में इस विधि का एक संस्करण विकसित Bephore (के लिए संगत इलेक्ट्रॉन-बीम और photoresist)27, जो विशेष रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घटकों और उपयोग अनुक्रम विशेष डीएनए किनारा आक्रमण प्रतिक्रियाओं पर आधारित था के लिए चिप आधारित कृत्रिम कोशिकाओं के निर्माण के लिए एक सरल-को-लागू multistep लिथोग्राफी प्रक्रिया की प्राप्ति । प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध ओवरव्यू चित्र 1में दिखाया गया है । यह डीएनए hairpin अणुओं पर आधारित होता है जिसमें एक photocleavable समूह होता है, जो एक सुसंगत खूंटी परत पर मैटीरियल होता है । hairpin के Photocleavage एक एकल-कतरा toehold अनुक्रम को उजागर करता है, जिसके माध्यम से ब्याज की डीएनए अणु (“” जिले अनुक्रम की जगह “) toehold मध्यस्थता किनारा आक्रमण के माध्यम से संलग्न किया जा सकता है युक्त ।
जबकि Bephore संभावित लागू करने के लिए आसान है, डेज़ी बहुत घने और साफ “जीन ब्रश” है, जो कुछ अनुप्रयोगों में लाभ है की प्राप्ति की अनुमति देता है । सिद्धांत रूप में, तथापि, डेज़ी और Bephore लिथोग्राफी आसानी से संयुक्त किया जा सकता है । सोने पर डीएनए ब्रश संरचना के लिए डीएनए किनारा विस्थापन का उपयोग एक संबंधित लिथोग्राफी विधि पहले हुआंग एट अलद्वारा विकसित किया गया था, लेकिन सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति28,29के संदर्भ में उपयोग नहीं किया गया था ।
निंनलिखित प्रोटोकॉल में हम Bephore विधि का उपयोग सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति के लिए डीएनए ब्रश के उत्पादन का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं । हम वर्णन कैसे जीन चिप्स गढ़े है और बहु के उपयोग के लिए कदम फोटो-एक चिप पर जीन के स्थानिक संरचित स्थिरीकरण के लिए लिथोग्राफी का प्रदर्शन । हम भी प्रतिक्रिया मंडलों के निर्माण और पर चिप जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं के प्रदर्शन के लिए microfluidics के आवेदन पर चर्चा की ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Bephore लिथोग्राफी डीएनए या आरएनए के नमूनों में स्थिरीकरण के लिए एक मजबूत और बहुमुखी तकनीक है । फिर भी, प्रक्रिया कई कदम है, जो-अगर बदल-विफलता या प्रणाली के प्रदर्शन को कम करने के लिए एक स्रोत हो सकता है शामिल …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृतज्ञता वोक्सवैगन Stiftung (अनुदान no. ८९ ८८३) और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (अनुदान समझौते no. ६९४४१०-AEDNA) द्वारा इस परियोजना के लिए वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । M.S.-एस. GRK २०६२ के माध्यम से DFG द्वारा समर्थन स्वीकार करता है ।
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
References
- Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
- Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins – a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
- Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
- Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
- Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
- Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
- Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
- van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
- Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
- Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
- Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
- Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
- Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
- Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
- Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
- Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
