Funktionell yta-immobilisering av gener med utgångsämnet Strand deplacement litografi
Summary
Vi beskriver en enkel litografiska procedur för immobilisering av gen-längd DNA-molekyler på en yta, som kan användas för att utföra cellfria gen uttryck experiment på biochips.
Abstract
Immobilisering av gener på lithographically strukturerade ytor tillåter studier av konkurrensbetingat gen uttryck processer i ett öppet mikroflödessystem bioreaktor system. Till skillnad från andra metoder mot konstgjorda cellulära system tillåter sådan inställning för kontinuerlig med gen uttryck reagenser och samtidig dränering av avfallsprodukter. Detta underlättar genomförandet av cellfria gen uttryck processer över längre tidsperioder, vilket är viktigt för förverkligandet av dynamiska gen reglerande återkopplingssystem. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för tillverkning av genetiska biochips genom en enkel att använda litografisk teknik baserat på DNA strand deplacement reaktioner, som uteslutande använder kommersiellt tillgängliga komponenter. Vi ger också ett protokoll om integrering av konkurrensbetingat gener med ett Polydimetylsiloxan (PDMS)-baserat mikroflödessystem system. Vi visar dessutom att systemet är kompatibelt med Totalreflexion (Frida) fluorescensmikroskopi, som kan användas för direkt observation av molekylära interaktioner mellan DNA och molekyler som ingår i uttrycket mix.
Introduction
Cell-gratis genuttryck reaktioner är av stort intresse för olika applikationer i biokemi, bioteknik och syntetisk biologi. Cellfria uttrycket av proteiner var avgörande för beredning av rent protein prover, som låg till grund för ett flertal studier inom strukturbiologi. Exempelvis användes cellfria system framgångsrikt för uttrycket av protein komplex1 eller membranet proteiner2, som är svåra att producera med hjälp av cell-baserade uttryck. Noterbart cellfria genuttryck reaktioner användes också till att klarlägga den genetiska koden, börjar med den banbrytande experimenten av Nirenberg och Matthaei i 19613struktur.
Nyligen har det varit ett förnyat intresse för cellfria metoder inom bioteknik och syntetisk biologi4,5,6. Cell-gratis system kan utökas med icke-biologiska föreningar och komponenter av olika biologiska ursprung kan kombineras till lättare7. Även om cellfria system har uppenbara nackdelen att de inte ”växa och dela upp”, är det tänkbart att förbereda öppen cellfria bioreaktorer med grundläggande metaboliska funktioner och låt dem syntetisera metaboliter när medföljer enkla kol och energi ingångar8. Framväxande inom syntetisk biologi lovar cell-fria system att vara en mer förutsägbar ”chassi” för genomförandet av syntetiska biologiska funktioner.
För närvarande cellfria gen uttryck reaktioner utförs antingen med cell extrakt (från olika källor såsom bakterier, jäst, insekter), eller transkription och översättning system som var optimerad för olika tillämpningar (t.ex. prokaryota och eukaryota genuttryck, produktion av membranproteiner, etc.). Ett populärt protokoll för beredning av bakteriell cell extrakt (även kallat TXTL) lämnades nyligen av V. Noireaux och medarbetare9. Dess biofysiska egenskaper har varit grundligt kännetecknas10, och det TXTL systemet har redan använts framgångsrikt att utföra en serie komplexa biokemiska aktiviteter: exempelvis montering av funktionella bakteriofager via cellfria uttryck för phage genomet11, syntesen av bakteriell protein filament12eller genomförandet av cellfria gen kretsar13,14.
Ett annat system populära i cellfria syntetisk biologi är det ren systemet, som bereds från renade komponenter15,16. Jämfört med det TXTL systemet, innehåller det inte nukleaser eller protein nedbrytning maskiner. Samtidigt som nedbrytningen av linjära DNA är RNA-molekyler eller proteiner mindre problem i ren systemet, decay vägar är faktiskt viktigt för genomförandet av dynamiska funktioner. För att minska effekten av exonuclease nedbrytning av linjära gen mallar i systemet TXTL (genom RecBCD), har slutet-skydda GamS proteinet till vara adderat. Både TXTL och ren systemet är kommersiellt tillgängliga.
Ett ämne besläktade nära cellfria biologi oro att studera effekten av uppdelning på biokemiska reaktioner och ytterligare skapandet av konstgjorda cell-liknande strukturer eller protocells17,18,19 ,20. Forskning på konstgjorda celler oftast inkapsling av en biokemisk reaktion system inuti vesikulär fack tillverkade av fosfolipider eller andra amphiphiles. Medan sådana system hjälper till att utforska grundläggande aspekter av uppdelning, eller uppkomsten av cellularitet och självreproducerande strukturer, de möter de typiska problemen av slutna system: i avsaknad av en fungerande ämnesomsättning och lämpliga membranet transportmekanismer, det är svårt att hålla konkurrensbetingat reaktioner kör för längre tid – bränsle molekyler används upp och slaggprodukter ansamlas.
Ett intressant alternativ till olika fack inuti sådan cell-härma fack är den rumsliga organisationen av genetiskt material med photolithographic metoder. Immobilisering av ”gener på ett chip” var pionjärer av gruppen Bar-Ziv vid Weizmann Institutet mer än tio år sedan21. Bland de större frågor som hade att lösa var ospecifika adsorption av DNA och de potentiella denaturering av proteinerna på chip ytan. Bar-Ziv et al. utvecklat en dedikerad photolithography motstå kallas ”Daisy”, som bestod av en reaktiv terminal silan för immobilisering av motstå molekylerna på kiseldioxid ytor, distanshylsa lång polyetylenglykol (PEG) som säker biokompatibilitet och en photocleavable headgroup, som omvandlades till en reaktiv Amin vid bestrålning med ultraviolett (UV) ljus. Det har visats att Daisy kan användas att immobilisera gen-längd DNA-molekyler (med längder av flera kilo-baspar (kbp)) på en chip yta. Från en polymer fysik synvinkel representerade systemen polymer borstar ympade på ett fast substrat. På grund av hur polyelectrolyte DNA påverkas konformation av dessa borstar starkt av osmotisk och andra ion-specifika effekter22,23.
Viktigast av allt, har det visat att substrat-orörlig gener är fortfarande fungerande och kan transkriberas och översatt till RNA och protein. Gen borstar är tillgängliga för RNA polymeraser från lösning24och komplexa makromolekylära blandningen av transkription/översättningen är inte denatureras vid ytan. En av fördelarna med immobilisering av genetiska komponenter på ett substrat är att de kan användas i ett system av öppna mikroflödessystem-reaktorn som tillhandahålls kontinuerligt med små föregångare molekyler och från vilka restprodukter kan vara borttagna25 , 26.
Vi har nyligen utvecklat en variant av denna metod som kallas Bephore (för biokompatibla elektron-beam och fotoresist)27, som grundades uteslutande på kommersiellt tillgängliga komponenter och utnyttjas sekvens-specifika DNA strand invasion reaktioner för förverkligandet av ett enkel att implementera utgångsämnet litografi förfarande för skapandet av chip-baserade konstgjorda celler. En schematisk översikt över förfarandet visas i figur 1. Den är baserad på DNA hårnål molekyler som innehåller en photocleavable grupp, som är orörlig på ett biokompatibelt PEG-lager. Photocleavage för hårnål exponerar ett enkelsträngat fotfäste sekvens, genom vilka DNA molekyler av intresse (som innehåller sekvensen ”tränger” DIS) kan vara anslutna via fotfäste-medierad strand invasion.
Medan Bephore är potentiellt enklare att genomföra, Daisy möjliggör förverkligandet av mycket tät och ren ”genen penslar”, som har fördelar i vissa applikationer. I princip, men kan Daisy och Bephore litografi enkelt kombineras. En relaterad litografi metod utnyttjar DNA strand deplacement för att strukturera DNA borstar på guld har tidigare utvecklats av Huang et al., men var inte utnyttjas i samband med cellfria gen uttryck28,29.
I följande protokoll ger vi en detaljerad beskrivning av produktionen av DNA borstar för cellfria genuttryck med metoden Bephore. Vi beskriver hur genen chips tillverkas och demonstrera användningen av flera steg foto-litografi för rumsligt strukturerad immobilisering av gener på ett chip. Vi diskuterar också tillverkning av reaktion chambers och tillämpningen av mikrofluidik för utförandet av på-chip gen uttryck reaktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bephore litografi är en robust och mångsidig teknik för mönstrade immobilisering av DNA eller RNA. Men förfarandet omfattar flera steg, som – om ändrat – kan vara en källa för misslyckande eller minskat systemets prestanda.
Ett avgörande steg i tillverkningen av Bephore marker är pegylering av substratet, vilket ger biokompatibiliteten av ytan. Här är steget rengöring med en RCA-förfarandet viktigt, eftersom det aktiverar också ytan för den efterföljande silanisering. Under de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner tacksamt ekonomiskt stöd för detta projekt av den Volkswagen Stiftung (grant nr 89 883) och European Research Council (grant avtal nr 694410 – AEDNA). M.S.-S. erkänner stöd av DFGEN genom GRK 2062.
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
References
- Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
- Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins – a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
- Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
- Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
- Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
- Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
- Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
- van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
- Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
- Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
- Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
- Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
- Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
- Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
- Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
- Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
