Multiplexed fluorescerende immunohistochemische kleuring, Imaging en analyse in histologische monsters van lymfoom
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor multiplex fluorescerende immunohistochemische kleuring en imaging voor de gelijktijdige localisatie van meerdere kanker-geassocieerde antigenen in lymfoom. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de colocalization analyse van biomarkers binnen alle weefselsecties.
Abstract
Immunohistochemische (IHC) methoden voor de analyse van de in-situ van eiwit expressie door de lichte microscopie is een krachtig hulpmiddel voor zowel onderzoek en diagnostische doeleinden. Echter is de visualisatie en de kwantificering van meerdere antigenen in een enkele weefselsectie met behulp van conventionele chromogenic IHC uitdagend. Multiplexed imaging is vooral relevant in lymfoom onderzoek en diagnostiek, waar markeringen moeten worden geïnterpreteerd in de context van een complexe tumor communicatie. Hier beschrijven we een protocol voor multiplexed fluorescerende IHC kleuring zodat de kwantitatieve beoordeling van meerdere doelen in specifieke celtypen belangstelling lymfoom. De methode omvat aspecten van validatie van antilichaam, antilichaam optimalisatie, de multiplex optimalisatie met markeringen van lymfoom subtypen, de kleuring van weefsel microarray (TMA) dia’s en het scannen van dia’s, gevolgd door data-analyse, met specifieke verwijzing naar lymfoom. Met behulp van deze methode, worden scores voor zowel het gemiddelde intensiteit van een marker van belang en het percentage positiviteit gegenereerd om verdere kwantitatieve analyse. Multiplexing minimaliseert monster benutting en ruimtelijke informatie voor iedere markeerdraad van belang.
Introduction
Lymfoïde gezwellen worden veroorzaakt door de ongecontroleerde kwaadaardige proliferatie van lymfocyten. Deze cellen zijn essentiële componenten van het immuunsysteem en lokaliseren naar de primaire en secundaire immuun organen, zoals het beenmerg, lymfeklieren, milt en andere mucosa-geassocieerde lymfoïde systeem. Lymfoïde gezwellen zijn een heterogene groep van stoornissen die worden geclassificeerd gebaseerd op een constellatie van functies, waaronder morfologie, immunophenotype, genetische kenmerken, en klinische presentatie. Terwijl elke parameter een rol speelt, afkomst blijft een kenmerkend en vormt de basis voor de WHO classificatiesysteem die gezwellen afgeleid van natural killer (NK) cellen1, B-cellen en T-cellen herkent.
Sleutel tot de classificatie van lymfoom is de karakterisatie van de antilichamen tegen leukocyten oppervlakte merkers van de verschillende subtypen van lymfocyten2. Immunohistochemistry (IHC) heeft van oudsher wordt gebruikt voor de analyse van deze markers en is gebaseerd op het beginsel van de erkenning van de specifieke antigeen-antilichaam aan de cel – en weefsel-gebaseerde moleculen die kunnen worden gevisualiseerd door de lichte Microscoop detecteren 3. de identificatie van meerdere doelen voor een enkele dia door conventionele helder-veld chromogenic multiplex IHC heeft echter beperkingen omdat het vaak moeilijk te onderscheiden van meerdere signalen van de kleur op een enkele weefselsectie betrouwbaar — met name voor antigenen met een zeer lage expressie4. Visuele beoordeling en kwantificering van kleuring kunnen ook subjectief, variabiliteit veroorzaakt in de analyse en data interpretatie5.
Conventionele IHC op monsters van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) dus niet haalbaar voor de simultane detectie van meerdere doelen in via het immuunsysteem veroorzaakte uiteenlopende ziekten zoals lymfoom. Bovendien is het vaak onnauwkeurig neoplastische lymfocyten van de omliggende immuuncellen onderscheid te maken. Dit belemmert de studies te kijken naar de relevantie van nieuwe biomarkers in lymfoom. In dit verband, multiplex fluorescerende IHC (mf-IHC) biedt een veelbelovend alternatief als hierdoor de kwantitatieve beoordeling van antigeen coexpression en een ruimtelijke relatie met hogere precisie terwijl het behoud van de beperkte monsters6,7. Wanneer deze imaging technologie is een partnerschap aangegaan met de software van de analyse van de digitale beelden, de data interpretatie bestaat efficiënter en vergemakkelijkt de studie van de tumor en communicatie heterogeniteit8,9. In dit protocol, een tyramide gebaseerde immunofluorescentie (IF) Multiplex methode wordt toegepast op het signaal versterken en is compatibel met elke IHC-gevalideerde antilichaam van elke soort die host, zelfs die zijn ontwikkeld in de dezelfde soort5,7 , 10. de tyramide-gebaseerd protocol voorziet in de directe Woordherkomst en-opbouw van de fluorophore aan het weefsel van belang zodat de primaire en secundaire antilichaam kan worden gestript na elke stap, waardoor de sequentiële toepassing van meerdere vlekken zonder antilichaam Kruisallergie.
Een multiplexed strategie zal zitten nuttig voor het voorspellen van de resultaten van de prognose en behandeling door het identificeren van doelstellingen en hun variant immunologische patronen in lymfomen. Multiplex TL IHC is toegepast in ons lab voor de studie van een panel van T en B-lymfocyt markers en T-folliculaire helper markeringen in angioimmunoblastic T-cel lymfoom (AITL), een subtype van een perifere T-cel lymfoom gekenmerkt door agressieve klinische gedrag en tumor heterogeniteit11. Het nut van deze methode wordt ook geïllustreerd in diffuus grote B-cel lymfoom (DLBCL) waar de toegenomen signalering van een B-cel receptor met gelijktijdige C-MYC en BCL-2 uitdrukking het potentiële therapeutische gebruik van Bruton van tyrosine kinase remming suggereert 12 .
Hier beschrijven we het gehele protocol van antilichaam validatie bij de selectie van passende controlemaatregelen weefsels en multiplex met behulp van lymfoom FFPE weefsels, met een eventuele analyse van gebeitst dia’s met behulp van een standaardscanoptie geautomatiseerde kwantitatieve pathologie imaging systeem.
Protocol
Representative Results
Discussion
MF-IHC heeft het potentieel om pathologen verfijnen diagnosticcriteria lymfoïde pathologie en analyseren van de rol van biomarkers in specifieke celtypen richting een voorspelling van klinische resultaten. Als een nieuwe onderzoeksmethode, wordt mf-IHC steeds meer toegepast op de kwantitatieve en ruimtelijke identificatie van meerdere immuun parameters van tumor cellen17. De detectie van mf-IHC voor de co expressie van tumor biomarkers gebleken reproduceerbaar zijn en betrouwbare<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.-B.N. en A.D.J. worden ondersteund door de Singapore ministerie van volksgezondheid nationale medische onderzoek Raad overgang Awards (NMRC/TA/0020/2013 en NMRC/TA/0052/2016). De auteurs erkennen een onderzoeksbeurs van Yong Siew Yoon aan A.D.J. van de nationale universiteit kanker instituut van Singapore naar de aankoop van een Vectra spectrale imaging Microscoop. Deze studie is goedgekeurd door de Singapore NHG domein specifieke Review Board B (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
- Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
- Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
- PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).
