Çoğaltılmış floresan immunohistokimyasal boyama, görüntüleme ve analiz lenfoma histolojik örneklerinde
Summary
Burada tarif biz multiplex floresan immunohistokimyasal boyama ve lenfoma içinde birden fazla kanser ilişkili antijenleri eş zamanlı yerelleştirme için görüntüleme için bir iletişim kuralı. Bu iletişim kuralı tüm doku bölümleri içinde biyolojik colocalization analizine genişletilebilir.
Abstract
İmmunohistokimyasal (IHC) yöntemleri protein ifade tarafından ışık mikroskobu in-situ analizi için araştırma ve teşhis amaçlı güçlü bir araç vardır. Ancak, görselleştirme ve miktar geleneksel chromogenic IHC kullanarak bir tek doku bölümünde birden çok antijenleri zorlu. Çoğaltılmış görüntü burada işaretleri karmaşık tümör microenvironment bağlamında yorumlanmalıdır lenfoma araştırma ve teşhis, özellikle alakalı olduğunu. Burada bir iletişim kuralı için birden çok hedef belirli hücre türleri lenfoma ilgi kantitatif değerlendirilmesi etkinleştirmek için boyama çoğaltılmış floresan IHC açıklar. Yöntem sunumunun antikor doğrulama, antikor optimizasyonu, lenfoma alt türlerinden işaretçileri olan optimizasyon multiplex, boyama doku Mikroarray (TMA) slayt ve slayt, tarama veri analizi, özel ile takip Lenfoma için başvuru. Bu yöntemi kullanarak, bir işaretleyici faiz ve yüzde pozitif her iki ortalama yoğunluğu için bir puan daha fazla Nicel analiz kolaylaştırmak için oluşturulur. Çoğullama örnek kullanımını en aza indirir ve ilgi her işaretçi için mekansal bilgi sağlar.
Introduction
Lenfoid neoplazmlar lenfositler tarafından malign kontrolsüz çoğalması kaynaklanır. Bu hücreler bağışıklık sisteminin önemli bileşenleri ve kemik iliği, lenf düğümleri, dalak ve diğer mukoza ilişkili lenfoid sistemi gibi birincil ve ikincil bağışıklık organlara localize. Lenfoid neoplazmlar morfoloji, immunophenotype, genetik özellikleri ve klinik sunum dahil olmak üzere özellikleri, bir takımyıldızı üzerinde göre sınıflandırılır bozuklukları heterojen bir grup vardır. Her parametre bir rol oynar, lineage bir belirleyici özelliği, kalır ve B hücreleri, T hücreleri ve doğal öldürücü (NK) hücreleri1elde neoplazmlar tanıyan WHO sınıflandırma sistemi temelini oluşturur.
Anahtar lenfoma sınıflandırılması için lökosit yüzey işaretleyicileri lenfositler2çeşitli alt türlerinden karşı antikor karakterizasyonu olmuştur. İmmünhistokimya (IHC) geleneksel olarak böyle işaretleri analiz için kullanılan ve ışık mikroskobu görüntülenmiştir hücre ve doku esaslı molekülleri algılamak için spesifik antijen-antikor tanıma prensibi temel alır 3. ancak, genellikle birden çok renk sinyalleri bir tek doku bölümünde güvenilir bir şekilde ayırt etmek zor olduğu için geleneksel alan parlak chromogenic multiplex IHC tarafından tek bir slayda birden çok hedef tanımlaması sınırlamaları vardır — özellikle bir çok düşük ifade4ile antijenleri için. Görsel değerlendirme ve boyama miktar da öznel, analiz ve veri yorumu5‘ te değişkenlik neden olabilir.
Bu nedenle, geleneksel IHC formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) örnekleri üzerinde aynı anda birden çok hedef lenfoma gibi immunologically çeşitli hastalıklarda tespiti için mümkün değildir. Ayrıca, çevredeki bağışıklık hücreleri neoplastik lenfositler ayırt kez imprecise. Bu lenfoma roman biyolojik alaka bakarak çalışmaları engeller. Bu bağlamda, multiplex floresan IHC (mf-IHC) antijen coexpression nicel bir değerlendirme sağlar ve mekansal ilişki sınırlı korunması ise daha yüksek hassasiyet ile6,örnekleri olarak umut verici bir alternatif sunuyor7. Bu görüntüleme teknolojisi dijital görüntü analiz yazılımı ile ortaklık, veri yorumu daha verimli hale ve tümör ve microenvironment heterojenlik8,9çalışma kolaylaştırır. Bu iletişim kuralı yöntemi çoğullama tyramide tabanlı bir ayirt (Eğer) sinyali yükseltmek için uygulanır ve herhangi bir IHC doğrulanmış antikor türlerden herhangi bir ana bilgisayar, hatta aynı tür5,7 ‘ geliştirilen ile uyumludur , 10. tyramide tabanlı iletişim kuralı için fluorophore faiz dokuya doğrudan konjugasyon sağlar, böylece birden fazla lekeleri sıralı uygulama için izin önce her defasında, birincil ve ikincil antikor elimden antikor olan.
Çoğaltılmış bir strateji lenfomalarin bazilarinin varyant onların immünolojik desenleri ve hedefler belirleyerek teşhis ve tedavi sonuçları tahmin için faydalı olacaktır. Multiplex floresan IHC T ve B lenfosit işaretleri ve angioimmunoblastic T-Hücre Lenfomasi (AITL), T-foliküler yardımcı işaretleyicilerini bir panel incelenmesi için bizim laboratuvarında uygulanan alt türü olan periferik T Hücre Lenfomasi karakterize agresif tarafından klinik davranış ve tümör heterojenite11. Belgili tanımlık yarar bu yöntemin de nerede bir B-hücre reseptör eşzamanlı C-MYC ve BCL-2 ifadesi ile artan sinyal Bruton’ın Tirozin kinaz inhibisyon potansiyel terapötik kullanım öneriyor diffüz büyük B hücreli lenfoma içinde (DLBCL) resimli 12 .
Burada tüm antikor doğrulama kuralından seçime uygun denetim dokuların açıklamak ve lenfoma FFPE kullanarak çoğullama kurcalayarak lekeli slaytlar bir tarama kullanarak nihai bir analizini otomatik nicel patoloji görüntüleme sistem.
Protocol
Representative Results
Discussion
MF-IHC patologlar diagnosticcriteria içinde lenfoid patoloji rafine ve biyolojik belirli hücre tiplerinin klinik sonuç bir tahmin doğru olarak rolü çözümlemek için etkinleştirmek için potansiyele sahiptir. Yeni bir araştırma yöntemi olarak mf-IHC giderek tümör hücreleri17birden çok bağışıklık parametre nicel ve mekansal tanımlaması uygulanır. Mf-IHC tümör biyolojik ortak bir ifade için algılama tekrarlanabilir ve güvenilir5olmak gösterilmişt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.-B.N. ve A.D.J. Singapur Sağlık Bakanlığı’nın Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi geçiş ödüller tarafından (NMRC/TA/0020/2013 ve NMRC/TA/0052/2016) desteklenir. Yazarlar bir Yong Siew Yoon araştırma hibe Singapur Ulusal Üniversitesi Kanser Enstitüsü Vectra spektral görüntüleme mikroskop satın doğru gelen A.D.J. için kabul. Bu çalışmada Singapur NHG etki alanı belirli İnceleme Kurulu B tarafından onaylanmıştır (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
- Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
- Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
- PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).
