多重蛍光免疫組織化学染色、イメージング、およびリンパ腫の組織学的試料中の分析
Summary
ここで多重蛍光免疫組織染色とリンパ腫における複数のがん関連抗原の同時定位のためのイメージング プロトコルについて述べる。このプロトコルは、すべての組織切片内バイオ マーカーの共局在解析に拡張できます。
Abstract
光学顕微鏡によるタンパク質発現の場分析のため免疫組織化学 (IHC) メソッドは、研究および診断目的の両方のための強力なツールです。しかし、可視化と従来の発色 IHC を使用して単一のティッシュ セクションで複数の抗原の定量化は困難です。多重化されたイメージングでは特に関連リンパ腫研究、診断、マーカーが複雑な腫瘍微小環境のコンテキストで解釈しなければなりません。ここで多重蛍光 IHC 染色リンパ腫への関心の特定の細胞型の複数のターゲットの定量的評価を有効にするためのプロトコルについて述べる。メソッドは、側面をカバーして抗体検証、抗体最適化、リンパ腫サブタイプのマーカーと多重最適化、組織マイクロ アレイ (TMA) スライドとスライドのスキャンの染色続いて特定のデータ解析リンパ腫を参照します。このメソッドを使用すると、両方の平均強度の関心と割合の陽性マーカーのスコアがさらに定量的な解析が容易に生成されます。多重サンプルの使用率を最小限に抑え、各マーカーに関心のある情報空間を提供します。
Introduction
リンパ系腫瘍はリンパ球の無秩序の悪性増殖によって引き起こされます。これらの細胞は、免疫システムの重要なコンポーネントし、骨髄、リンパ節、脾臓、その他粘膜関連リンパ系など、プライマリとセカンダリの免疫臓器にローカライズします。リンパ腫瘍は、機能、形態、イムノフェノ タイプ、遺伝的特徴、臨床症状などの星座に基づいて分類される無秩序の異質グループです。各パラメーターは、役割を果たしている、リネージュ定義の特徴のまま、B 細胞、T 細胞および自然なキラー (NK) 細胞1から派生した腫瘍を認識する WHO 分類体系のための基礎を形作る。
リンパ腫の分類にキーは、白血球リンパ球2のさまざまなサブタイプの表面マーカーに対する抗体の評価をされています。免疫組織染色 (IHC) は伝統的にそのようなマーカーの分析のために使用されているし、顕微鏡的に視覚化できる細胞・組織ベースの分子を検出する抗体抗原認識の原則に基づいて3ですしかし、従来明視野発色多重 IHC によって 1 枚のスライドに複数のターゲットの同定、制限単一ティッシュ セクションで複数の色信号を確実に区別するために困難なことが多いため、特に。非常に低い式4抗原の視感評価と染色の定量化は、主観的、分析およびデータ解釈5の変動を引き起こすことができます。
そのため、ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) サンプルに従来の IHC はリンパ腫のような多様な免疫学的疾患の複数のターゲットを同時検出するため不可能です。さらに、周囲の免疫細胞から腫瘍性リンパ球を区別する正確ではありません多くの場合です。これはリンパ腫における新規バイオ マーカーの関連性を見て研究を妨げています。多重蛍光 IHC (mf IHC) をこのコンテキストではそれにより抗原共発現の定量的評価と限定を節約しながら、精度の高い空間的な関係のサンプル6,に有望な代替手段を提供しています7.このイメージング技術は、デジタル画像解析ソフトウェアと提携して、データ解釈はさらに効率的、腫瘍微小環境の不均一性8,9の研究が容易になります。このプロトコルの多重化通信方式パスチラミドシグナル ベースの蛍光 (IF) 信号を増幅するのに適用され、あらゆるホスト種であっても同じ種5,7の開発から IHC 検証抗体と互換性のあります。,10. パスチラミドシグナル ベースのプロトコルは、興味のティッシュに fluorophore の直接接合複数汚れの逐次適用を可能にする、各ステップの後、一次および二次抗体を取り除くことができますので、なし抗体の交差反応します。
多重化された戦略は、ターゲットとリンパ腫におけるバリアント免疫学的パターンを特定することにより予後の治療成績を予測するため役に立つでしょう。多重蛍光 IHC の T および B リンパ球のマーカーと T 濾胞ヘルパー T 細胞血管免疫芽球性リンパ腫 (AITL)、マーカー パネルの調査のため研究室に適用されている積極的なによって臨床的に特徴づけられる末梢性 T 細胞リンパ腫のサブタイプ行動と腫瘍の不均一性の11。このメソッドの有用性を示したびまん性大 B 細胞リンパ腫 (DLBCL)、ブルートンのチロシンキナーゼ阻害の潜在的な治療上の使用を示唆している同時 C-MYC と BCL 2 式と B 細胞受容体の信号を増加しました。12.
ここで適切な管理組織の選択に抗体検証から全体のプロトコルについて述べるし、リンパ腫 FFPE を用いた多重スキャンを使用して染色スライドの最終的な分析と組織自動定量病理学画像システム。
Protocol
Representative Results
Discussion
mf IHC 病理リンパ病理学における diagnosticcriteria を修正し、臨床転帰の予測に向けた特定の細胞型におけるバイオ マーカーの役割を分析するを有効にする可能性があります。新しい研究方法としては、mf IHC ますます腫瘍細胞17の複数の免疫パラメーターの定量的および空間同定に適用されます。腫瘍マーカーの共発現の mf IHC の検出は、再現性と信頼性の高い5</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. B.N. と A.D.J. は、シンガポール保健省国立医療研究評議会移行賞 (ナノ材研/TA/0020/2013 とナノ材研/TA/0052/2016) でサポートされます。著者は、ベクトラ スペクトル イメージング顕微鏡の購入に向けてシンガポールの国民大学癌研究所から A.D.J. に容 Siew 尹研究助成を認めます。本研究はシンガポール NHG ドメイン特定のレビュー ボード B によって承認されて (2014/00693)。
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
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