Мультиплексированных флуоресцентные иммуногистохимическое окрашивание, визуализации и анализа в гистологической образцы лимфомы
Summary
Здесь мы описываем протокол для мультиплекс флуоресцентные иммуногистохимическое окрашивание и изображений для одновременного локализации нескольких связанных рака антигенов в лимфомы. Этот протокол может быть продлен на colocalization анализ биомаркеров в всех разделах ткани.
Abstract
Иммуногистохимический (IHC) методы для in situ анализ выражения протеина, световой микроскопии являются мощным инструментом для исследовательских и диагностических целей. Однако визуализации и количественной оценки нескольких антигенов в разделе одной ткани с помощью обычных хромогенных IHC является сложной задачей. Мультиплексированных изображений является особенно актуальным в лимфома исследований и диагностики, где маркеры должны толковаться в контексте сложных опухоли микроокружения. Здесь мы описываем протокол для мультиплексных флуоресцентные IHC пятнать возможность количественной оценки несколько целевых объектов, в типах конкретных клеток интереса к лимфомы. Метод охватывает аспекты проверки антитела, антитела оптимизации, мультиплекс оптимизации с маркерами лимфомы подтипы, окрашивание ткани microarray (TMA) слайдов, и сканирование слайдов, а затем анализа данных, с конкретными Ссылка для лимфомы. С помощью этого метода, ноты для средней интенсивности маркером интерес и процент позитивность создаются для облегчения дальнейшего количественного анализа. Мультиплексирование минимизирует образец использования и обеспечивает пространственной информации, представляющей интерес для каждого маркера.
Introduction
Новообразования лимфоидной, вызванных бесконтрольного распространения злокачественного лимфоцитов. Эти клетки являются жизненно важными компонентами иммунной системы и локализации первичного и вторичного иммунных органов, например костного мозга, лимфатические узлы, селезенка и другие слизистой оболочки ассоциированной лимфоидной системы. Лимфоидных образований являются гетерогенной группы расстройств, которые классифицируются на основании созвездие функций, включая морфологии, иммунофенотип, генетические особенности и клинической картины. Хотя каждый параметр играет роль, линии остается определяющей чертой и формирует основу для системы классификации ВОЗ, которая признает новообразования, производные от клетки B, Т-клеток и естественных убийца (НК) клетки1.
Ключ к классификации лимфомы была характеристика антител против лейкоцита поверхностных маркеров различных подтипов лимфоцитов2. Иммуногистохимия (IHC) традиционно используется для анализа таких маркеров и основывается на принципе признания конкретных антиген антитело для обнаружения на основе клеток и тканей молекул, которые могут быть визуализированы через световой микроскоп 3. Однако, выявление нескольких целевых объектов на одном слайде, обычных ярко поле хромогенных мультиплекс IHC имеет ограничения, потому что это часто трудно отличить несколько сигналов цвет на участке одной ткани надежно — особенно для антигенов с очень низким выражение4. Также может быть субъективным, вызывая изменчивость в интерпретации анализа и данных5визуальной оценки и количественного определения окраски.
Таким образом обычные IHC на формалин исправлена, парафин врезанных образцов (FFPE) возможна не для одновременного обнаружения нескольких целей в иммунологически разнообразных заболеваний, как лимфома. Кроме того отличительный неопластических лимфоцитов из окружающих иммунные клетки часто является неточным. Это препятствует исследований, глядя на актуальность Роман биомаркеров в лимфомы. В этом контексте, мультиплекс флуоресцентные IHC (mf-IHC) предлагает перспективные альтернативы как позволяет количественной оценки ИССЛЕДОВАНИџ антигена и пространственные отношения с более высокой точностью при сохранении ограниченный образцы6,7. При этой технологии визуализации в партнерстве с программное обеспечение для анализа цифровых изображений, интерпретации данных производится более эффективным и облегчает исследование опухоли и микроокружения неоднородность8,9. В этом протоколе на основе tyramide иммунофлюоресценции (если) мультиплексирования метод применяется для усиления сигнала и совместим с любой ИГХ проверены антитела от любых видов хост, даже тех, которые разработаны в том же видов5,7 , 10. протокол на основе tyramide позволяет для прямого спряжение Флюорофор в ткани интерес так, что после каждого шага, позволяя для последовательного применения нескольких пятен могут быть лишены первичного и вторичного антитела без антитела перекрестной реактивности.
Мультиплексированных стратегия будет полезной для прогнозирования прогноз и лечение результатов путем определения целей и их вариант иммунологические закономерности в лимфом. Мультиплекс люминесцентные IHC был применен в нашей лаборатории для изучения группы маркеры лимфоцитов B и T и T-фолликулярная вспомогательные маркеры в angioimmunoblastic Т-клеточная лимфома (AITL), подтип периферической Т-клеточной лимфомы характеризуется агрессивным клинических поведение и опухоли неоднородность11. Полезность этого метода также иллюстрируется диффузный большой B-клеточной лимфомы (ККЛ), где увеличилась сигнализации B-клеточный рецептор с одновременным BCL-2 и C-MYC выражение предполагает потенциал терапевтического использования Брутон ингибирование киназы тирозина 12 .
Здесь мы описываем весь протокол от проверки антитела к выбору соответствующего управления тканей и мультиплексирование с помощью лимфома FFPE ткани, с возможного анализа окрашенных слайдов с помощью сканирования автоматизированных количественные патологии изображений системы.
Protocol
Representative Results
Discussion
MF-IHC имеет потенциал для включения патологоанатомов для уточнения diagnosticcriteria в лимфоидных патологии и анализировать роль биомаркеров в типах конкретных клеток к предсказание клинических исходов. Как новый метод исследования mf-IHC все чаще применяется для количественного и пространстве…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Министерство здравоохранения Сингапура национальных медицинских исследований Совета переходного периода награды (NMRC/TA/0020/2013 и NMRC/TA/0052/2016) поддерживаются S.-б.н. и A.D.J.. Авторы признают Сью Ен Юн исследовательский грант A.D.J. из Национального института университета рака Сингапура к покупке спектральных тепловизионных микроскопом Vectra. Это исследование одобрено Сингапур NHG домена конкретного обзора Совет B (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
- Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
- Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
- PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).
