Gemultiplexten fluoreszierende immunhistochemische Färbung, Bildverarbeitung und Analyse in histologischen Proben des Lymphoms
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für Multiplex-fluoreszierende immunhistochemische Färbung und imaging für die gleichzeitige Lokalisierung von mehreren Krebs-assoziierte Antigene in Lymphom. Dieses Protokoll kann für die NS1 Analyse von Biomarkern in allen Gewebeschnitte erweitert werden.
Abstract
Immunhistochemische (IHC) Methoden für die in-Situ -Analyse der Proteinexpression durch Lichtmikroskopie sind ein mächtiges Werkzeug für Forschung und Diagnostik. Die Visualisierung und Quantifizierung von mehreren Antigenen in einem einzigen Gewebe-Abschnitt mit konventionellen chromogenen IHC ist jedoch anspruchsvoll. Gemultiplexten Bildgebung ist besonders relevant in der Lymphom-Forschung und Diagnostik, wo Markierungen im Rahmen einer komplexen Tumor Mikroumgebung interpretiert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für Multiplex fluoreszierende IHC Färbung um die quantitative Bewertung der mehrere Ziele in bestimmten Zelltypen des Interesses an Lymphom zu ermöglichen. Die Methode umfasst Aspekte der Antikörper-Validierung, Antikörperoptimierung, die Multiplex-Optimierung mit Markern der Lymphom-Subtypen, die Färbung des Gewebes Microarray (TMA) rutschen und das Scannen von Dias, gefolgt von Datenanalyse, mit spezifischen Verweis auf Lymphom. Mit dieser Methode werden Noten für beide die mittlere Intensität der Marker für die Zinsen und die prozentuale Positivität generiert, um Quantitative Analyse weiter zu erleichtern. Multiplexen minimiert Probe Auslastung und bietet interessante räumliche Informationen für jede Markierung.
Introduction
Lymphoide Neubildungen entstehen durch das unkontrollierte maligne Proliferation von Lymphozyten. Diese Zellen sind wichtige Komponenten des Immunsystems und die primäre und sekundäre immun Organe wie Knochenmark, Lymphknoten, Milz und anderen Mukosa-assoziierten lymphatischen System zu lokalisieren. Lymphatischen Tumoren bilden eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die eingestuft werden, basierend auf einer Konstellation von Features, einschließlich Morphologie, Immunophenotype, genetischen Eigenschaften und klinische Präsentation. Während jeder Parameter eine Rolle spielt, bleibt ein bezeichnendes Merkmal Abstammung und bildet die Grundlage für das Klassifikationssystem der WHO, das Neubildungen abgeleitet von B-Zellen, T-Zellen und natürlichen killer (NK) Zellen1erkennt.
Entscheidend für die Einstufung des Lymphoms ist die Charakterisierung von Antikörpern gegen Leukozyten Oberflächenmarker der verschiedenen Untertypen von Lymphozyten2gewesen. Immunhistochemie (IHC) ist traditionell für die Analyse solcher Marker benutzt worden und basiert auf dem Prinzip der spezifischen Antigen-Antikörper-Anerkennung, Zell- und gewebebasierten Moleküle erkennen, die durch das Lichtmikroskop visualisiert werden können 3. die Identifizierung von mehreren Zielen auf eine einzelne Folie durch konventionelle Hellfeld chromogene multiplex IHC hat jedoch Einschränkungen, da es oft schwierig, mehrere Farbsignale auf einem einzigen Gewebe zuverlässig zu unterscheiden ist – vor allem für Antigene mit sehr geringe Expression4. Visuelle Beurteilung und Quantifizierung der Färbung auch kann subjektiv, Variabilität in der Analyse und Interpretation5verursachen.
Deshalb ist herkömmlichen IHC auf Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Proben nicht möglich für die simultane Detektion von mehreren Zielen bei immunologisch unterschiedlichen Erkrankungen wie Lymphom. Darüber hinaus ist die Unterscheidung neoplastischer Lymphozyten aus den umliegenden Immunzellen oft ungenau. Dies behindert den Studien über die Relevanz der neue Biomarker Lymphom. In diesem Zusammenhang multiplex fluoreszierende IHC (mf-IHC) bietet eine viel versprechende Alternative, da die quantitative Bewertung von Antigen Coexpression und eine räumliche Beziehung mit höherer Präzision bei gleichzeitiger Einsparung von begrenzt6,Proben7. Wenn diese imaging-Technologie eine mit der digitalen Bildanalyse-Software Partnerschaft ist, die Interpretation der Daten ist effizienter gestaltet und erleichtert das Studium der Tumor und Mikroumgebung Heterogenität8,9. In diesem Protokoll eine Tyramide-basierte Immunfluoreszenz (IF) multiplexing-Verfahren wird angewendet, um das Signal zu verstärken und ist kompatibel mit jedem IHC validiert Antikörper aus jedem Wirtsarten, auch diejenigen entwickelt, die in der gleichen Spezies5,7 , 10. Tyramide-basiertes Protokoll ermöglicht die direkte Konjugation der Fluorophor des Gewebes von Interesse, dass die primäre und sekundäre Antikörper nach jedem Schritt, die sequenzielle Anwendung mehrere Flecken entfernt werden kann ohne Antikörper Kreuzreaktivität.
Eine gebündelte Strategie wird für die Vorhersage Prognose und Behandlung Ergebnisse durch die Identifizierung von Zielen und deren Variante immunologischen Muster in Lymphome nützlich sein. Multiplex-Leuchtstofflampen IHC angewendet wurde in unserem Labor für die Studie eines Panels von T- und B-Lymphozyten und T-follikulären Helfer Marker Angioimmunoblastic T-Zell-Lymphom (AITL), ein Subtyp des eine periphere T-Zell-Lymphom zeichnet sich durch aggressive klinische Verhalten und Tumor Heterogenität11. Der Nutzen dieser Methode zeigt auch diffuse große B-Zell-Lymphom (DLBCL) wo die erhöhte Signalisierung eines B-Zell-Rezeptors mit gleichzeitiger C-MYC und BCL-2 Ausdruck den möglichen therapeutischen Einsatz von Brutons Tyrosin-Kinase Hemmung schlägt 12 .
Hier beschreiben wir das gesamte Protokoll von Antikörper-Validierung, die Auswahl der angemessenen Kontrolle Gewebe und Multiplexen mit Lymphom FFPE Gewebe, mit einer späteren Analyse der gefärbten Folien mit einer Scan-automatisierte quantitative Pathologie Bildgebung System.
Protocol
Representative Results
Discussion
MF-IHC hat das Potenzial, Pathologen, Diagnosticcriteria in lymphatischen Pathologie zu verfeinern und Analyse die Rolle von Biomarkern in bestimmten Zelltypen in Richtung einer Vorhersage des klinischen Ergebnisses ermöglichen. Als eine neue Forschungsmethode ist mf IHC zunehmend auf die quantitative und räumliche Identifizierung von mehreren Immunparameter Tumor Zellen17angewendet. Die Erkennung von mf-IHC Co Ausdruck der Tumor Biomarker hat sich gezeigt, reproduzierbare und zuverlässige<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.-B.N und A.D.J. werden von Singapur Gesundheitsministeriums medizinische Forschung Rat Übergang Staatspreise (NMRC/TA/0020/2013 und NMRC/TA/0052/2016) unterstützt. Die Autoren erkennen ein Forschungsstipendium Yong Siew Yoon, A.D.J. von der National University Cancer Institut von Singapore in Richtung zum Kauf von einem Vectra spectral imaging Mikroskop. Diese Studie ist von Singapur NHG Domäne bestimmte Review Board B zugelassen (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
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