멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석
Summary
여기 우리는 다중 형광 immunohistochemical 얼룩 및 여러 암 관련 항 림프 종에서의 동시 지역화에 대 한 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 섹션에서 생체의 colocalization 분석을 확장할 수 있습니다.
Abstract
Immunohistochemical (IHC) 방법 가벼운 현미경 검사 법에 의해 단백질 표정에 현장 분석에 대 한 연구와 진단 목적을 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 시각화 및 정량화 기존의 비 IHC를 사용 하 여 단일 조직 섹션에서 여러 개의 항 원에의 도전 이다. 멀티플렉스 이미징 관계가 특히 림프 종 연구와 진단, 마커 복잡 한 종양 microenvironment의 맥락에서 해석 될 수 있다. 여기 우리는 멀티플렉스 형광 IHC 림프 종에 대 한 관심의 특정 세포 유형에 여러 대상의 양적 평가 있도록 얼룩에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 방법 측면 커버 유효성 검사 항 체, 항 체 최적화, 림프의 표식이 있는 멀티플렉스 최적화, 데이터 분석, 특정 뒤 조직 microarray (TMA) 슬라이드 및 슬라이드, 스캔의 얼룩 림프 종 참조. 이 메서드를 사용 하 여 모두 관심과 백분율 양성의 감 적의 평균 강도 대 한 점수는 정량 분석을 더 촉진 하기 위하여 생성 됩니다. 멀티플렉싱 샘플 사용률을 최소화 하 고 각 표식에 대 한 관심의 공간 정보를 제공 합니다.
Introduction
림프 신생 세포의 억제 되지 않는 악성 확산에 의해 발생 합니다. 이 세포 면역 시스템의 중요 한 구성 요소 이며, 골 수, 림프절, 비장, 및 다른 점 막 관련 림프 시스템 등 기본 2 차 면역 기관에 지역화. 림프 신생 형태학, immunophenotype, 유전자 기능 및 임상 프레 젠 테이 션을 포함 하 여 특징의 별자리에 따라 분류는 누가 장애의 다른 유형의 그룹입니다. 각 매개 변수는 역할을, 하는 동안 혈통 정의 기능을 유지 하 고 인식 하는 B 세포, T 세포 및 자연적인 살인자 (NK) 세포1에서 파생 된 신생 WHO 분류 시스템에 대 한 기초를 형성.
림프 종의 분류에 키 림프 톨2의 다양 한 하위의 백혈구 표면 표식에 대 한 항 체의 특성화 되었습니다. Immunohistochemistry (IHC) 전통적으로 이러한 마커 분석에 사용 되었습니다과 가벼운 현미경 통해 구상 될 수 있다 세포 및 조직 기반 분자 검출에 특정 항 원-항 체 인식의 원리에 따라 그러나 3. 기존의 밝은 필드 비 멀티플렉스 IHC에서 단일 슬라이드에 여러 목표물의 식별 한계가 있기 때문에 그것은 종종 단일 조직 섹션에 여러 개의 색상 신호를 안정적으로 구분 하기 어려운-특히 매우 낮은 식4의 항 원에 대 한 육안 평가 및 정량화 얼룩의 주관적, 분석 및 데이터 해석5에 변화를 일으키는 될 수 있습니다.
따라서, 기존의 IHC에 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 샘플은 림프 종 같은 면역학 다양 한 질병에 여러 목표물의 동시 검색 가능 합니다. 또한, 주변의 면역 세포에서 종양 약 세포를 구별 하지 않습니다 정확 하 게. 이 림프 종에 소설 biomarkers의 관련성을 보고 하는 연구를 방해. 이러한 맥락에서 다중 형광 IHC (mf-IHC) 제공 유망한 대안 항 coexpression의 양적 평가 허용 및 제한 보존 하는 동안 더 높은 정밀도로 공간 관계6,7. 이 이미징 기술은 디지털 이미지 분석 소프트웨어와 제휴는 때 데이터 해석은 보다 효율적 및 종양과 microenvironment이8,9의 연구를 용이 하 게 한다. 이 프로토콜에는 tyramide 기반 면역 형광 (IF) 다중화 방법 신호를 증폭 하는 적용 되 고 같은 종5,7 에 개발도 그 어떤 호스트 종에서 어떤 IHC 검증 항 체와 호환 , 10. 1 차 및 이차 항 체는 여러 얼룩의 순차 응용 프로그램에 대 한 허용 하는 각 단계 후 박탈 될 수 있도록 관심의 조직에 fluorophore의 직접 활용에 대 한 tyramide 기반 프로토콜 허용 항 체 분 없이.
멀티플렉스 전략 목표 및 림프 종에서 그들의 변종 면역학 패턴을 식별 하 여 예 후와 치료 결과 예측 하는 데 유용 있을 것입니다. IHC T와 B 림프 구 마커 및 angioimmunoblastic T-세포 림프 종 (AITL)에서 T-follicular 도우미 마커 패널의 연구에 대 한 우리의 실험실에 적용 된 다중 형광 주변 T 세포 림프 종의 하위 공격적으로 임상 특징 동작 및 종양이11. 이 방법의 유틸리티는 또한 확산 큰 B-세포 림프 종 (DLBCL) 어디 Bruton의 티로신 키 니 아 제 억제의 잠재적인 치료 사용 제안 동시 C-MYC 및 BCL-2 식을 B 세포 수용 체의 신호 증가에 나와 있는 12 .
여기 우리는 적절 한 컨트롤 조직 선택 항 체 유효성 검사에서 전체 프로토콜 설명 및 림프 FFPE를 사용 하 여 멀티플렉싱 조직, 스캔을 사용 하 여 스테인드 슬라이드의 최종 분석 자동화 양적 병리학 이미징 시스템입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
mf IHC 병리학 림프 병 리에 diagnosticcriteria를 수정 하 고 임상 결과의 예측으로 특정 세포 유형에서 바이오 마커의 역할 분석을 사용 하도록 가능성이 있다. 새로운 연구 방법으로 mf IHC 점점 종양 세포17의 여러 면역 매개의 양적 및 공간 확인에 적용 됩니다. 종양 마커의 공동 식 mf IHC의 검출 재현성 및 신뢰성5표시 되었습니다. 그러나, 기술은 초기와 시 약 및 조?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. B.N. 및 A.D.J. 싱가포르의 보건의 국립 의학 연구 위원회 전환 어워드 (NMRC/TA/0020/2013 NMRC/TA/0052/2016)에 의해 지원 됩니다. 저자는 싱가포르 국립 대학 암 연구소의 Vectra 스펙트럼 영상 현미경의 구입으로에서 A.D.J.에 용 Siew 윤 연구 그랜트를 인정합니다. 이 연구는 싱가포르 NHG 도메인 특정 검토 보드 B에 의해 승인 (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
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