La macchiatura di Immunohistochemical fluorescente multiplex, Imaging e analisi in campioni istologici di linfoma
Summary
Qui descriviamo un protocollo per multiplex immunohistochemical fluorescente di colorazione e di imaging per la localizzazione simultanea di più antigeni tumore-associati nel linfoma. Questo protocollo può essere esteso all’analisi di colocalizzazione dei biomarcatori all’interno di tutte le sezioni di tessuto.
Abstract
Metodi di immunoistochimica (IHC) per l’analisi in situ di espressione della proteina da microscopia chiara sono un potente strumento per la ricerca sia gli scopi diagnostici. Tuttavia, la visualizzazione e la quantificazione degli antigeni multipli in un singolo tessuto sezione utilizzando convenzionali cromogenico IHC è impegnativo. Multiplex imaging è particolarmente rilevante nella ricerca di linfoma e di diagnostica, dove gli indicatori devono essere interpretate nel contesto di un microambiente tumorale complesse. Qui descriviamo un protocollo per multiplex fluorescente IHC che macchia per permettere la valutazione quantitativa di bersagli multipli in tipi cellulari specifici di interesse nel linfoma. Il metodo copre gli aspetti della convalida dell’anticorpo, ottimizzazione dell’anticorpo, l’ottimizzazione multiplex con marcatori di sottotipi di linfoma, la colorazione dei vetrini di tessuto microarray (TMA) e la scansione delle diapositive, seguita da analisi dei dati, con specifico riferimento per linfoma. Spartiti per sia l’intensità media di un marcatore di interesse e la percentuale di positività, utilizzando questo metodo, vengono generati per facilitare ulteriormente l’analisi quantitativa. Multiplexing riduce al minimo l’utilizzo di esempio e vengono fornite informazioni spaziali per ogni indicatore di interesse.
Introduction
Neoplasie linfoidi sono causati dalla incontrollata proliferazione maligna dei linfociti. Queste cellule sono componenti fondamentali del sistema immunitario e si localizzano gli organi immuni primari e secondari, quali il midollo osseo, nei linfonodi, milza e altri sistema linfoide mucosa-collegato. Neoplasie linfoidi sono un gruppo eterogeneo di disordini che sono classificati basato su una costellazione di caratteristiche, tra cui morfologia, immunofenotipo, caratteristiche genetiche e presentazione clinica. Mentre ogni parametro svolge un ruolo, lignaggio rimane una caratteristica distintiva e costituisce la base per il sistema di classificazione del WHO che riconosce neoplasma derivati dalle cellule B, cellule T e natural killer (NK) cellule1.
Chiave per la classificazione di linfoma è stata la caratterizzazione degli anticorpi contro gli indicatori della superficie del leucocita dei vari sottotipi di linfociti2. Immunohistochemistry (IHC) è stato tradizionalmente usato per l’analisi di tali indicatori e si basa sul principio del riconoscimento antigene-anticorpo specifico per rilevare molecole cellulari e tissutali che possono essere visualizzati attraverso il microscopio ottico 3. Tuttavia, l’identificazione di bersagli multipli su una singola diapositiva di convenzionale campo chiaro cromogenico multisala IHC ha limitazioni perché spesso è difficile distinguere attendibilmente più segnali di colore su una sezione di tessuto singolo — soprattutto per gli antigeni con un’ espressione molto bassa4. Valutazione visiva e quantificazione di colorazione può anche essere soggettivi, causando la variabilità nella interpretazione analisi e dati5.
Di conseguenza, IHC convenzionale su campioni di formalina-fisse, paraffina (FFPE) non è fattibile per la rilevazione simultanea di più destinazioni in immunologicamente diverse malattie come il linfoma. Inoltre, distinguendo i linfociti neoplastici dalle cellule immuni circostante è spesso impreciso. Questo ostacola studi esaminando la rilevanza di nuovi biomarcatori nel linfoma. In questo contesto, multisala fluorescente IHC (mf-IHC) rappresenta un’alternativa promettente poiché permette la valutazione quantitativa della coexpression di antigene e un rapporto spaziale con maggiore precisione, conservando limitato campioni6,7. Quando questa tecnologia di imaging è una partnership con il software di analisi di immagine digitale, l’interpretazione dei dati è reso più efficiente e facilita lo studio del tumore e microambiente eterogeneità8,9. In questo protocollo, un basati su microarray immunofluorescenza (IF) multiplexing metodo viene applicato per amplificare il segnale ed è compatibile con qualsiasi anticorpo IHC-convalidato da qualsiasi specie di ospiti, anche quelli sviluppati nella stessa specie5,7 , 10. il protocollo basato su microarray permette per la coniugazione diretta del fluoroforo al tessuto di interesse affinché l’anticorpo primario e secondario possa essere rimossi dopo ogni passaggio, consentendo l’applicazione sequenza di macchie multiple senza cross-reattività dell’anticorpo.
Una strategia di “multiplex” sarà utile per stimare la prognosi ed il trattamento risultati identificando obiettivi e loro modelli variant immunologiche nei linfomi. Multisala fluorescenti IHC è stato applicato nel nostro laboratorio per lo studio di un pannello di marcatori di T e dei linfociti B e T-follicolare helper nel linfoma a cellula T angioimmunoblastic (AITL), un sottotipo di un linfoma a cellula T periferico caratterizzato da aggressivo clinica comportamento e tumore eterogeneità11. L’utilità di questo metodo è illustrato anche nel linfoma diffuso della B-cellula grande (DLBCL) dove la segnalazione aumentata di un recettore della B-cellula con espressione simultanea di C-MYC e BCL-2 suggerisce il potenziale impiego terapeutico di inibizione di chinasi della tirosina di Bruton 12 .
Qui descriviamo l’intero protocollo dalla convalida dell’anticorpo alla selezione dei tessuti di controllo appropriato e multiplexing con linfoma FFPE tessuti, con un’eventuale analisi di vetrini colorati utilizzando una scansione automatizzata imaging quantitativo patologia sistema.
Protocol
Representative Results
Discussion
MF-IHC ha il potenziale per abilitare i patologi per perfezionare diagnosticcriteria in patologia linfoide e di analizzare il ruolo dei biomarcatori in tipi cellulari specifici verso un pronostico del risultato clinico. Come un nuovo metodo di ricerca, mf-IHC è sempre più applicate all’identificazione quantitativa e spaziale dei parametri immuni multipli del tumore le cellule17. La rilevazione di mf-IHC per la co-espressione di biomarcatori del tumore ha dimostrata di essere affidabile e riprodu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.-B.N. e a.d.j. sono supportati da National Medical Research Consiglio transizione Awards di Singapore Ministero della salute (NMRC/TA/0020/2013 e NMRC/TA/0052/2016). Gli autori riconoscono un Yong Siew Yoon Research Grant per A.D.J National University Cancer Institute di Singapore verso l’acquisto di un microscopio di imaging spettrale di Vectra. Questo studio è approvato dal Singapore NHG dominio specifico Review Board B (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
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