מרובבת פלורסנט נוגדן, הדמיה, וניתוח בדגימות היסטולוגית של לימפומה
Summary
כאן נתאר פרוטוקול עבור מולטיפלקס immunohistochemical פלורסנט מכתים והדמיה עבור ההתאמה סימולטני של אנטיגנים מרובים הקשורים לסרטן ב לימפומה. פרוטוקול זה ניתן להרחיב את הניתוח colocalization של סמנים ביולוגיים בתוך כל מקטעי רקמת.
Abstract
Immunohistochemical (IHC) שיטות לניתוח מקומיים של ביטוי חלבונים על ידי מיקרוסקופ אור הן כלי רב עוצמה עבור המחקר והן למטרות אבחון. עם זאת, ויזואליזציה של כימות של אנטיגנים מרובים במקטע בודד רקמות באמצעות IHC הדפסות כסף קונבנציונלי הוא מאתגר. הדמיה מרובבת רלוונטי במיוחד לימפומה מחקר, אבחון, שבו סמני צריך לפרש בהקשר של microenvironment הגידול מורכב. כאן נתאר פרוטוקול עבור מרובבת IHC פלורסנט מכתים כדי לאפשר את הערכה כמותית של מטרות מרובות סוגי תאים ספציפיים עניין בלימפומה. השיטה מכסה היבטים של נוגדן אימות, נוגדן אופטימיזציה, אופטימיזציה מולטיפלקס עם סמנים של סוגי לימפומה, צביעה של רקמת microarray (TMA) שקופיות ולאחר סריקה של השקופיות, ואחריו ניתוח נתונים, ספציפיות התייחסות לימפומה. באמצעות שיטה זו, הציונים של עוצמת בשני אכזרי של סמן של עניין את הגישה החיובית אחוז נוצרים כדי להקל עוד יותר על אנליזה כמותית. ריבוב ממזער מדגם ניצול ומספק מידע מרחבי עבור כל סמן עניין.
Introduction
Neoplasms הלימפה נגרמות על ידי מבוקרת ממאיר של לימפוציטים. תאים אלה הם מרכיבים חיוניים של המערכת החיסונית, בתרגום לאיברים המערכת החיסונית ראשוני ומשני, כגון מח העצם, בלוטות הלימפה, טחול, מערכת הלימפה אחרים רירית הקשורים. Neoplasms הלימפה הם קבוצה הטרוגנית של הפרעות אשר מסווגים מבוסס על מערך של תכונות, כולל מורפולוגיה, immunophenotype, תכונות גנטיות של המצגת קליניים. בעוד כל פרמטר ממלא חלק, שושלת היוחסין נשאר המגדיר תכונה ו מהווה את הבסיס עבור מערכת סיווג WHO אשר מזהה neoplasms שמקורם בתאי B ותאי T, טבעי רוצח (NK) תאים1.
המפתח הסיווג של לימפומה כבר אפיון הנוגדנים נגד ליקוציט סמני פני השטח של תתי סוגים שונים של לימפוציטים2. אימונוהיסטוכימיה (IHC) משמשת לניתוח של סמנים כזה והיא מבוססת על העיקרון של ההכרה אנטיגן-נוגדן ספציפי כדי לזהות מולקולות תאים רקמות מבוססות להיות visualized באמצעות מיקרוסקופ אור 3. עם זאת, הזיהוי של מטרות מרובות בשקופית אחת מאת בהיר-שדות קונבנציונלי IHC מולטיפלקס הדפסות כסף יש מגבלות מאחר שלעיתים קשה להבחין אותות צבע מרובים על קטע רקמה אחת אמינה — במיוחד עבור אנטיגנים עם ביטוי נמוך4. הערכה חזותית כימות של צביעת ניתן גם סובייקטיבית, גורם השתנות ניתוח ונתונים לפרשנות5.
לכן, IHC המקובלת על דגימות (FFPE) פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע אינו ריאלי עבור גילוי סימולטני של מטרות מרובות במחלות immunologically מגוונות כמו לימפומה. יתר על כן, הבחנה לימפוציטים אמצעים מתאי מערכת החיסון שמסביב לעתים קרובות מדויק. זה מעכבת מחקרים מסתכל על הרלוונטיות של סמנים חדשניים לימפומה. בהקשר זה, IHC מולטיפלקס פלורסנט (mf-IHC) מציע חלופה מבטיח כמו זה מאפשר את הערכה כמותית של אנטיגן coexpression יחסים מרחביים עם דיוק גבוה יותר תוך שימור מוגבלת דגימות6,7. כאשר טכנולוגיית הדמיה זו היא שותפות עם התוכנה ניתוח תמונה דיגיטלי, פרשנות הנתונים מורכב יותר יעיל ואסטמה ומקילה על המחקר של הגידול, microenvironment הטרוגניות8,9. ב פרוטוקול זה, המבוסס על tyramide immunofluorescence (אם) שיטת ריבוב מוחל כדי להיקלט והוא תואם עם כל נוגדן IHC לאמת של כל מין המארח, אפילו אלה שפותחו ב-5,מינים באותו7 , 10. פרוטוקול מבוסס-tyramide מאפשר ההטיה ישירה של fluorophore לרקמות של הריבית כך נוגדן ראשוני ומשני ניתן הברקה לאחר כל שלב, המאפשרות יישום רציף של כתמים מרובים ללא נוגדנים אשיג.
אסטרטגיה מרובבת תהיה שימושית לניבוי תוצאות פרוגנוזה וטיפול על ידי זיהוי מטרות ודפוסי שלהם משתנה אוטואימונית ב לימפומות. מולטיפלקס פלורסנט IHC הוחל שלנו במעבדה לחקר פאנל של סמנים T ו- B לימפוציטים, סמני helper T-הזקיקים angioimmunoblastic T-cell לימפומה (AITL), תת סוג של לימפומה T-cell היקפיים מאופיין על ידי אגרסיבי קליני ההתנהגות ואת הגידול הטרוגניות11. השירות של שיטה זו מומחש גם ב- ‘ מאטום לשקוף ‘ B-cell לימפומה גדולים (DLBCL) איפה האיתות מוגברת של קולטן B-cell עם C-MYC סימולטני והביטוי BCL-2 מרמז על השימוש טיפולית פוטנציאל טירוזין קינאז עיכוב של ברוטון 12 .
כאן נתאר פרוטוקול כולו של נוגדן אימות לבחירה של רקמות הפקד המתאים ואת ריבוב באמצעות לימפומה FFPE רקמות, עם ניתוח בסופו של דבר של ויטראז’ים השקופיות באמצעות סריקה של כלים אוטומטיים הפתולוגיה הכמותית הדמיה מערכת.
Protocol
Representative Results
Discussion
mf-IHC יש הפוטנציאל לאפשר פתולוגים לעידון diagnosticcriteria בפתולוגיה הלימפה, כדי לנתח את התפקיד של סמנים ביולוגיים סוגי תאים ספציפיים לכיוון חיזוי של התוצאה הקלינית. כשיטת מחקר חדש, mf-IHC מוחלת יותר ויותר על הזיהוי המרחבי וסטטיסטי של פרמטרים מרובים המערכת החיסונית של תאי הגידול17. הגילו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ס-תרגוםאולפני ו- A.D.J. נתמכים על ידי נבחרת רפואי מחקר מועצת המעבר פרסים של סינגפור משרד הבריאות (NMRC/ת א/0020/2013 ו- NMRC/ת א/0052/2016). המחברים לאשר מענק מחקר יונג יון Siew כדי A.D.J. מ באוניברסיטה הלאומית סרטן המכון של סינגפור לקראת רכישת מיקרוסקופ הדמיה ספקטרלי וקטרה. מחקר זה אושרה על ידי סינגפור NHG תחום ספציפי סקירה לוח B (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
- Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
- Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
- PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).
