मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट Immunohistochemical धुंधला, इमेजिंग, और विश्लेषण लिंफोमा के ऊतकवैज्ञानिक नमूनों में
Summary
यहां हम मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट immunohistochemical धुंधला और एकाधिक कैंसर के एक साथ स्थानीयकरण के लिए इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-लिंफोमा में जुड़े एंटीजन । इस प्रोटोकॉल सभी ऊतक वर्गों के भीतर के colocalization विश्लेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
Abstract
प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति के इन-सीटू विश्लेषण के लिए Immunohistochemical (आइएचसी) तरीकों दोनों अनुसंधान और नैदानिक प्रयोजनों के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं । हालांकि, दृश्य और ठहराव पारंपरिक chromogenic आइएचसी का उपयोग कर एक एकल ऊतक अनुभाग में एकाधिक प्रतिजनों के चुनौतीपूर्ण है । मल्टीप्लेक्स इमेजिंग लिंफोमा अनुसंधान और निदान, जहां मार्करों एक जटिल ट्यूमर microenvironment के संदर्भ में व्याख्या की है में विशेष रूप से प्रासंगिक है । यहां हम मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट आइएचसी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए लिंफोमा में ब्याज की विशिष्ट कोशिका प्रकार में कई लक्ष्यों के मात्रात्मक मूल्यांकन सक्षम धुंधला । विधि एंटीबॉडी सत्यापन के पहलुओं को शामिल किया गया, एंटीबॉडी अनुकूलन, लिंफोमा उपप्रकार के मार्कर के साथ मल्टीप्लेक्स अनुकूलन, ऊतक microarray के धुंधला (TMA) स्लाइड, और स्लाइड की स्कैनिंग, डेटा विश्लेषण के द्वारा पीछा किया, विशिष्ट के साथ लिंफोमा के संदर्भ में । इस विधि का प्रयोग, दोनों के लिए स्कोर ब्याज की एक मार्कर और प्रतिशत धनात्मकता का मतलब तीव्रता के लिए और अधिक मात्रात्मक विश्लेषण की सुविधा उत्पंन कर रहे हैं । division नमूना उपयोग को कम करता है और प्रत्येक रुचि के मार्कर के लिए स्थानिक जानकारी उपलब्ध कराता है ।
Introduction
लसीकावत् ट्यूमर लिम्फोसाइटों के अनियंत्रित घातक प्रसार के कारण होते हैं । इन कोशिकाओं प्रतिरक्षा प्रणाली के महत्वपूर्ण घटक है और प्राथमिक और माध्यमिक प्रतिरक्षा अंगों के लिए स्थानीयकरण, अस्थि मज्जा, लिम्फ नोड्स, तिल्ली, और अन्य म्यूकोसा से जुड़े लसीकावत् प्रणाली के रूप में । लसीकावत् ट्यूमर विकारों का एक विषम समूह है जो सुविधाओं का एक नक्षत्र, आकृति विज्ञान, immunophenotype, आनुवंशिक सुविधाओं, और नैदानिक प्रस्तुति सहित, के आधार पर वर्गीकृत कर रहे हैं । जबकि प्रत्येक पैरामीटर एक हिस्सा निभाता है, वंश एक परिभाषित विशेषता बनी हुई है और जो वर्गीकरण प्रणाली जो बी कोशिकाओं, टी कोशिकाओं से व्युत्पंन ट्यूमर पहचानता है के लिए आधार रूपों, और प्राकृतिक खूनी (NK) कोशिकाओं1।
लिंफोमा के वर्गीकरण के लिए कुंजी2लिम्फोसाइटों के विभिंन उपप्रकार के ल्युकोसैट सतह मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी के लक्षण वर्णन किया गया है । Immunohistochemistry (आइएचसी) परंपरागत रूप से ऐसे मार्करों के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है और विशिष्ट प्रतिजन-एंटीबॉडी मांयता के सिद्धांत पर आधारित कोशिका का पता लगाने के लिए और ऊतक आधारित अणुओं है कि प्रकाश माइक्रोस्कोप के माध्यम से visualized किया जा सकता है 3. हालांकि, पारंपरिक उज्ज्वल क्षेत्र chromogenic मल्टीप्लेक्स आइएचसी द्वारा एक ही स्लाइड पर कई लक्ष्यों की पहचान सीमाएं है क्योंकि यह अक्सर एक एकल ऊतक अनुभाग मज़बूती पर एकाधिक रंग संकेतों को भेद करने के लिए मुश्किल है-विशेष रूप से एक बहुत कम अभिव्यक्ति के साथ एंटीजन के लिए4. दृश्य मूल्यांकन और धुंधला के ठहराव भी व्यक्तिपरक किया जा सकता है, विश्लेषण और डेटा व्याख्या5में परिवर्तनशीलता के कारण ।
इसलिए, formalin पर पारंपरिक आइएचसी-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) नमूने लिंफोमा जैसे immunologically विविध रोगों में कई लक्ष्यों का एक साथ पता लगाने के लिए संभव नहीं है । इसके अलावा, आसपास के प्रतिरक्षा कोशिकाओं से नवोत्पादित लिम्फोसाइटों भेद अक्सर गलत है । यह लिंफोमा में उपंयास की प्रासंगिकता को देख अध्ययन में बाधा है । इस संदर्भ में, मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट आइएचसी (mf-आइएचसी) एक होनहार विकल्प प्रदान करता है के रूप में यह प्रतिजन coexpression के मात्रात्मक मूल्यांकन और उच्च परिशुद्धता के साथ एक स्थानिक संबंध जबकि संरक्षण सीमित नमूने6,7 की अनुमति देता है । जब इस इमेजिंग तकनीक को डिजिटल इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर के साथ साझेदारी की जाती है तो डाटा की व्याख्या को और अधिक कुशल बनाया जाता है और ट्यूमर और microenvironment विविधता8,9के अध्ययन की सुविधा मिलती है । इस प्रोटोकॉल में, एक tyramide आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IF) मल्टीप्लेक्सिंग विधि संकेत बढ़ाना करने के लिए लागू किया जाता है और किसी भी मेजबान प्रजातियों में से किसी भी आइएचसी-मान्य एंटीबॉडी के साथ संगत है, यहां तक कि एक ही प्रजाति में विकसित उन5,7 , 10. tyramide आधारित प्रोटोकॉल ब्याज के ऊतकों को fluorophore के प्रत्यक्ष विकार के लिए अनुमति देता है ताकि प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी प्रत्येक चरण के बाद छीन लिया जा सकता है, एकाधिक दाग के अनुक्रमिक आवेदन के लिए अनुमति बिना एंटीबॉडी क्रॉस-रिजेट ।
एक मल्टीप्लेक्स रणनीति लक्ष्य की पहचान और लिंफोमा में उनके संस्करण immunologic पैटर्न द्वारा पूर्वानुमान और उपचार के परिणामों की भविष्यवाणी के लिए उपयोगी हो जाएगा । मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट आइएचसी टी के एक पैनल के अध्ययन के लिए हमारी प्रयोगशाला में लागू किया गया है और बी लिम्फोसाइट मार्करों और टी-angioimmunoblastic टी सेल लिंफोमा (AITL) में तोंसिल्लितिस सहायक मार्कर, एक उपप्रकार के एक परिधीय टी सेल लिंफोमा आक्रामक नैदानिक द्वारा विशेषता व्यवहार और ट्यूमर विविधता11. इस पद्धति की उपयोगिता भी फैलाना बड़े बी सेल लिंफोमा (DLBCL) में सचित्र है, जहां एक साथ बी-सेल रिसेप्टर के बढ़ संकेतन एक साथ सी-MYC और BCL-2 अभिव्यक्ति है Bruton tyrosine कळेनासे निषेध के संभावित चिकित्सीय उपयोग का सुझाव 12 .
यहाँ हम एंटीबॉडी सत्यापन से पूरे प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए उपयुक्त नियंत्रण ऊतकों और division का उपयोग लिंफोमा FFPE ऊतकों, सना हुआ स्लाइड का एक अंतिम विश्लेषण के साथ एक स्कैनिंग स्वचालित मात्रात्मक पैथोलॉजी इमेजिंग का उपयोग सिस्टम.
Protocol
Representative Results
Discussion
एमएफ-आइएचसी में लसीकावत् पैथोलॉजी में diagnosticcriteria को निखारने के लिए पैथोलॉजिस्ट को सक्षम करने और नैदानिक परिणाम की भविष्यवाणी की ओर विशिष्ट कोशिका प्रकारों में विमार्क्स की भूमिका का विश्लेषण करने की क्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एस.-भोलानाथ और A.D.J. का समर्थन कर रहे है सिंगापुर स्वास्थ्य मंत्रालय के राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद संक्रमण पुरस्कार (NMRC/टीए/0020/2013 और NMRC/टीए/0052/2016) । लेखक एक वेक्ट्रा वर्णक्रमीय इमेजिंग माइक्रोस्कोप की खरीद की ओर सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के कैंसर संस्थान से A.D.J. के लिए एक योंग Siew Yoon अनुसंधान अनुदान स्वीकार करते हैं । इस अध्ययन सिंगापुर NHG डोमेन विशिष्ट समीक्षा बोर्ड बी (2014/00693) द्वारा अनुमोदित है ।
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
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