Multiplexade fluorescerande immunhistokemisk färgning, bildbehandling och analys i histologiska prover av lymfom
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för multiplex fluorescerande immunhistokemisk färgning och tänkbar för samtidiga localizationen av flera cancer-associerade antigener i lymfom. Detta protokoll kan utvidgas till en colocalization analys av biomarkörer inom alla vävnadssnitt.
Abstract
Immunhistokemisk (IHC) metoder för in situ – analys av proteinuttryck av ljusmikroskop är ett kraftfullt verktyg för både forskning och diagnostiska ändamål. Men är den visualisering och kvantifiering av flera antigener i en enda vävnad avsnittet använda konventionella kromogen IHC utmanande. Multiplexade imaging är särskilt relevant i lymfom forskning och diagnostik, där markörer måste tolkas i samband med en komplex tumör mikromiljö. Här beskriver vi ett protokoll för multiplexering fluorescerande IHC färgning för att möjliggöra kvantitativa bedömningen av flera mål i specifika celltyper intresset för lymfom. Metoden omfattar aspekter av antikropp validering, antikropp optimering, multiplex optimering med markörer av lymfom subtyper, färgningen av vävnad microarray (TMA) diabilder, och skanning av bilderna, följt av analys, med särskild hänvisning till lymfom. Noter för båda genomsnittliga intensiteten av en markör av intresse och det procentuella positivitet skapas för att underlätta ytterligare kvantitativ analys och använder den här metoden. Multiplexing minimerar prov utnyttjande och tillhandahåller geografisk information för varje markör av intresse.
Introduction
Lymfoida tumörer orsakas av okontrollerad maligna spridningen av lymfocyter. Dessa celler är viktiga komponenter i immunsystemet och lokalisera till de primära och sekundära immun organ, såsom benmärg, lymfkörtlar, mjälte och andra slemhinnor-associerade lymfoida systemet. Lymfoida tumörer är en heterogen grupp av sjukdomar som klassificeras baserat på en konstellation av funktioner, inklusive morfologi, immunophenotype, genetiska särdrag och klinisk presentation. Varje parameter spelar en del, härstamning förblir en definierande funktion och utgör grunden för det WHO klassificeringssystem som erkänner tumörer härrör från B-celler, T-celler och naturliga killer (NK) celler1.
Nyckeln till klassificering av lymfom har varit karakterisering av antikroppar mot leukocyt yta markörer av olika undertyper av lymfocyter2. Immunhistokemi (IHC) har traditionellt använts för analys av sådana markörer och bygger på principen om antigen-antikroppsreaktion erkännande att upptäcka cell – och tissue-baserade molekyler som kan visualiseras genom mikroskopet ljus 3. identifiering av flera mål i en enda bild av konventionella ljusa fält kromogen multiplex IHC har dock begränsningar eftersom det är ofta svårt att skilja flera färg signaler på en enda vävnad avsnitt tillförlitligt — särskilt för antigen med en mycket låg uttryck4. Visuell bedömning och kvantifiering av färgning kan också vara subjektivt, orsakar variationer i analys och tolkning5.
Konventionella IHC på formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) prover är därför inte möjligt för samtidiga detektion av flera mål i immunologiskt olika sjukdomar som lymfom. Dessutom är skilja neoplastiska lymfocyter från omgivande immuncellerna ofta otydliga. Detta hindrar studier tittar på relevansen av nya biomarkörer i lymfom. I detta sammanhang multiplex fluorescerande IHC (mf-IHC) erbjuder ett lovande alternativ eftersom det tillåter den kvantitativa bedömningen av antigen coexpression och en rumslig relation med högre precision medan bevara begränsade prover6,7. När denna bildteknik är samarbetar med digital bild analys programvara, data tolkningen görs effektivare och underlättar studier av tumör och mikromiljö heterogenitet8,9. I detta protokoll, en tyramide-baserade immunofluorescens (om) multiplexing metod används för att förstärka signalen och är kompatibel med alla IHC-validerade antikroppar från någon värdarter, även de som utvecklats i samma arter5,7 , 10. tyramide-baserade protokollet möjliggör direkt konjugationen av fluorophore i vävnad av intresse så att de primära och sekundära antikroppen kan demonteras efter varje steg, vilket möjliggör sekventiell tillämpningen av flera fläckar utan antikropp korsreaktivitet.
En multiplexade strategi kommer att vara användbart för att förutsäga utfall prognos och behandling genom att identifiera mål och deras variant immunologiska mönster i lymfkörtelcancer. Multiplex fluorescerande IHC har tillämpats i vårt labb för studien av en panel av T- och B-lymfocyter markörer och T-follikulär helper markörer i angioimmunoblastic T-cells lymfom (AITL), en undertyp till en perifert T-cellslymfom kännetecknas av aggressiv klinisk beteende och tumör heterogenitet11. Nyttan av denna metod illustreras också i diffusa stora B-cellslymfom (DLBCL) där den ökad signalering av en B-cells receptor med samtidiga C-MYC och BCL-2 uttryck föreslår den potentiella terapeutiska användningen av Brutons tyrosin Kinas hämning 12 .
Beskriver här vi hela protokollet från antikropp validering till valet av lämplig kontroll vävnader och vävnader, med en eventuell analys av färgade bilder med hjälp av en skanning multiplexing använder lymfom FFPE och automatiserade kvantitativa patologi imaging systemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
MF-IHC har potential att aktivera patologer att förfina diagnosticcriteria i lymfoida patologi och analysera rollen av biomarkörer i specifika celltyper mot en förutsägelse av kliniskt resultat. Som en ny forskningsmetod används alltmer mf-IHC kvantitativa och rumsliga identifiering av flera immun parametrar av tumör celler17. Påvisande av mf-IHC av samtidig uttryck för tumör biomarkörer har visat sig vara reproducerbara och pålitlig5. Tekniken är dock fortfaran…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.-B.N. och A.D.J. stöds av Singapore hälsoministeriets nationella medicinska forskning rådet övergången Awards (NMRC/TA/0020/2013 och NMRC-TA-0052/2016). Författarna erkänner Yong Siew Yoon forskningsbidrag till A.D.J. från National University Cancer Institute of Singapore mot inköp av Vectra spectral imaging Mikroskop. Studien är godkänd av Singapore NHG domän specifika översyn styrelsens B (2014/00693).
Materials
| Antibody diluent | DAKO | REF S3022 | Blocking |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | For peroxide blocking |
| Vectra multispectral automated microscope | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | Spectral imaging |
| absolute Ethanol | EMSURE | 1.00983.2500 | Ethyl alcohol for rehydration |
| Amplification Diluent | PERKIN ELMER | FP1135 | Fluorophore diluent buffer |
| Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF822001EA | Secondary antibody |
| Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled | PERKIN ELMER | NEF812001EA | Secondary antibody |
| BCL2 | DAKO | clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) | primary antibody |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | primary antibody |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | primary antibody |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) | primary antibody |
| Cy 5 | PERKIN ELMER | FP1171 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software |
Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | Data Analysis software |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | primary antibody |
| KOS MILESTONE multifunctional tissue processor | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| Microwave | PANASONIC | NN-ST651M | Microwave stripping |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | mounting media |
| Opal 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal620 | PERKIN ELMER | FP1495 | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for tissue section adhesion in routine histological use |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | nucleic acid stain |
| Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | For HIER |
| Tris Buffer saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | for buffer wash |
| Tween 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1L | Tween |
References
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
- Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
- Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
- Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
- Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
- Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
- PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
- Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).
