Directe meting van KDM1A target engagement met behulp van Chemoprobe-gebaseerde immunoassay
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het meten van KDM1A doel betrokkenheid in een humane of dierlijke cel, weefsel of bloedmonsters behandeld met KDM1A remmers. Het protocol maakt gebruik van chemoprobe-tagging van het vrije KDM1A-enzym en de directe kwantificering van de doel bezetting met behulp van op chemoprobe gebaseerde immunoassays en kan worden gebruikt in preklinisch onderzoek en klinische studies.
Abstract
De beoordeling van de beoogde betrokkenheid, gedefinieerd als de interactie van een medicijn met het eiwit waarvoor het is ontworpen, is een basisvoorwaarde voor de interpretatie van de biologische activiteit van een samengestelde drug ontwikkeling of in basis onderzoeksprojecten. In Epigenetics wordt de doel betrokkenheid meestal beoordeeld door de analyse van proxy markers in plaats van het meten van de vereniging van de verbinding met het doel. Downstream biologische uitlezingen die zijn geanalyseerd omvatten de Histon Mark modulatie of genexpressie veranderingen. KDM1A is een lysine demethylase dat methylgroepen verwijdert uit mono-en dimethylated H3K4, een modificatie in verband met het uitzwijgen van genexpressie. Modulatie van de proxy markers is afhankelijk van het celtype en de functie van de genetische make-up van de onderzochte cellen, die interpretatie en Cross-case vergelijking vrij moeilijk kan maken. Om deze problemen te omzeilen, wordt een veelzijdig protocol gepresenteerd om de dosis effecten en de dynamiek van de directe KDM1A doel betrokkenheid te beoordelen. De beschreven test maakt gebruik van een KDM1A chemoprobe voor het vangen en kwantificeren van ongeremd enzym, kan breed worden toegepast op cellen of weefselmonsters zonder de noodzaak van genetische modificatie, heeft een uitstekend detectie venster en kan zowel voor fundamenteel onderzoek worden gebruikt en analyse van klinische monsters.
Introduction
Lysine specifieke demethylase 1 (KDM1A)1 is een demethylase betrokken bij de controle van gentranscriptie. Dit eiwit is ontstaan als een kandidaat farmacologisch doel2 in oncologie; waaronder acute myeloïde leukemie3 (AML), Myelodysplasie syndroom (MDS)4, myelofibrose (MF)5,6, kleincellige longkanker (SCLC)7; in sikkelcelziekte (SCD)8,9, en in het centrale zenuwstelsel ziekten met inbegrip van de ziekte van Alzheimer (AD), multiple sclerose (MS); en in agressie10.
De meeste van de KDM1A remmende verbindingen in de klinische ontwikkeling zijn cyclopropylamine derivaten en remmen het eiwit door covalente binding aan zijn flavine adenine dinucleotide (FAD) cofactor11. Remming van KDM1A induceert genexpressie veranderingen, maar deze veranderingen variëren enorm over weefsels, celtypen of ziektegevallen. Remming van KDM1A verandert ook Histon-markeringen12, maar deze veranderingen worden meestal lokaal geproduceerd op een specifieke site in het genoom, en zijn opnieuw, zeer weefsel-en celspecifiek.
Het protocol is ontwikkeld om direct KDM1A doel betrokkenheid bij biologische monsters te meten en is geoptimaliseerd voor gebruik met cycloopropylamine-remmers. De test is gebaseerd op ELISA-technologie en analyseert, parallel, totaal en vrij (d.w.z. ongebonden door remmer) KDM1A in een native proteïne-extract van een biologisch monster in een vaste fase test. Als eerste stap wordt het biologisch monster gelyseerd in aanwezigheid van de biotinyleerd KDM1A selectieve chemoprobe og-88113,14, afgeleid van de selectieve KDM1A remmer ORY-1001 (iadademstat), een krachtige remmer van KDM1A in klinisch ontwikkeling voor de behandeling van oncologische ziekte. De chemoprobe heeft een IC50 voor KDM1A van 120 nm en bevat een Fad binding gedeelte gekoppeld aan een biotinyleerd polyethyleenglycol (PEG)-staart. De chemoprobe bindt uitsluitend aan de vrije KDM1A, maar niet aan de KDM1A van de remmer in het monster. Na de binding van chemoprobe worden de KDM1A met complexen in het monster gevangen op microtiterplaten met streptavidine gecoat oppervlak om vrije KDM1A te bepalen, of op platen bekleed met een monoklonaal anti-KDM1A Capture antilichaam om de totale KDM1A te bepalen. Na het wassen worden beide platen geïnfiltreerd met een anti-KDM1A detectie-antilichaam, opnieuw gewassen, en geïnfiltreerd met een secundaire HRP-geconjugeerde ezel anti-Rabbit IgG antilichaam voor detectie met behulp van een luminescente substraat en kwantificering door het meten van relatieve verlichtingseenheden (RLU) in een luminometer (Figuur 1).
Figuur 1. Schema van ELISA-enzym gekoppeld chemoprobe-immunoabsorberende test voor KDM1A target engagement: A) bepaling van het totaal KDM1A met behulp van sandwich-Elisa en B) bepaling van vrije KDM1A met behulp van CHEMOPROBE Elisa. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
In beide ELISA-platen wordt een standaard curve opgenomen om de lineariteit van elke test te controleren. De bepaling van KDM1A doel betrokkenheid in elk monster wordt vervolgens berekend als een relatieve waarde voor de voor dosis of het behandelde monster.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol is ontwikkeld om KDM1A doel betrokkenheid direct te meten met behulp van een roman KDM1A chemoprobe Capture based ELISA. De methode is gevalideerd op gekweekte menselijke cellijnen en ex vivo monsters van mens, rat en muis en baviaan (inclusief PBMCs, longen, hersenen, huid, tumoren), maar kan gemakkelijk worden toegepast op andere soorten waarin het KDM1A antilichaam doelwit epitopen en katalytische centrum worden bewaard. Aangezien OG-881 een op activiteiten gebaseerde chemoprobe is, is…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, en deels ondersteund door het CIIP-20152001 en RETOS Collaboration Program RTC-2015-3332-1.
Materials
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T. ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia. Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).
- Sugino, N. A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).
- Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms. Blood. 126, 601 (2015).
- Jutzi, J. S., et al. LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone. HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).
- Mohammad, H. P. DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).
- Rivers, A., et al. RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model. Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).
- Rivers, A. Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons. Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).
- Buesa, C., et al. The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation. Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905 (2015).
- Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1. Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).
- Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).
- Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. , (2016).
- Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Rodriguez-Suarez, R. Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).
- Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1. Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).
- Schulz-Fincke, J. Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation. European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).
- Ishii, T., et al. CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens. Scientific Report. 7, 13000 (2017).
- Maes, T. ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192 (2017).
