Mesure directe de l'engagement cible de KDM1A à l'aide d'immunossays à base de chemoprobe
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour mesurer l’engagement cible de KDM1A dans une cellule humaine ou animale, des échantillons de tissu ou de sang traités avec des inhibiteurs de KDM1A. Le protocole emploie le marquage de chemoprobe de l’enzyme libre de KDM1A et la quantification directe de l’occupation cible utilisant des immuno-tests à base de chemoprobe et peuvent être employés dans des études précliniques et cliniques.
Abstract
L’évaluation de l’engagement cible, défini comme l’interaction d’un médicament avec la protéine pour laquelle il a été conçu, est une exigence fondamentale pour l’interprétation de l’activité biologique de tout composé dans le développement de médicaments ou dans les projets de recherche fondamentale. En épigénétique, l’engagement des cibles est le plus souvent évalué par l’analyse des marqueurs proxy au lieu de mesurer l’union du composé à la cible. Les résultats biologiques en aval qui ont été analysés comprennent la modulation de la marque histone ou les changements d’expression génique. KDM1A est une lysine demethylase qui élimine les groupes méthyliques du H3K4 mono et diméthylé, une modification associée au silence de l’expression génique. La modulation des marqueurs proxy dépend du type de cellule et de la fonction de la composition génétique des cellules étudiées, ce qui peut rendre l’interprétation et la comparaison entre les cas assez difficiles. Pour contourner ces problèmes, un protocole polyvalent est présenté pour évaluer les effets de dose et la dynamique de l’engagement cible direct de KDM1A. Le test décrit fait usage d’une chimioprobe KDM1A pour capturer et quantifier l’enzyme décomplexée, peut être largement appliqué aux cellules ou des échantillons de tissus sans avoir besoin de modification génétique, a une excellente fenêtre de détection, et peut être utilisé à la fois pour la recherche fondamentale et l’analyse d’échantillons cliniques.
Introduction
Lysine spécifique deméthylase 1 (KDM1A)1 est une deméthylase impliquée dans le contrôle de la transcription génique. Cette protéine est apparue comme une cible pharmacologique candidate2 en oncologie; y compris la leucémie myéloïde aigue3 (LAM), le syndrome de myélodie (SMD)4, myélofibrose (MF)5,6, Cancer du poumon à petites cellules (SCLC)7; dans la maladie des cellules de Sickle (SCD)8,9, et dans les maladies du système nerveux central, y compris la maladie d’Alzheimer (MA), la sclérose en plaques (SEP); et dans l’agression10.
La plupart des composés inhibiteurs du KDM1A dans le développement clinique sont des dérivés de cyclopropylamine et inhibent la protéine par liaison covalente à son dinucleotide d’adénine de flavine (FAD) cofacteur11. L’inhibition de KDM1A induit des changements d’expression génique, mais ces changements varient énormément selon les tissus, les types de cellules ou les cas de maladie. L’inhibition de KDM1A change également histone marques12, mais ces changements sont généralement produites localement à un site spécifique dans le génome, et sont à nouveau, fortement tissu et cellulaire spécifique.
Le protocole a été développé pour mesurer directement l’engagement cible de KDM1A dans des échantillons biologiques et a été optimisé pour l’utilisation avec des inhibiteurs dérivés de la cyclopropylamine. L’essai est basé sur la technologie ELISA et analyse, en parallèle, Total et Free (c’est-à-dire non lié par l’inhibiteur) KDM1A dans un extrait de protéine indigène d’un échantillon biologique dans une phase d’analyse solide. Dans un premier temps, l’échantillon biologique est lysé en présence de la chimioprobe sélective KDM1A biotinylated OG-88113,14, dérivée de l’inhibiteur sélectif KDM1A ORY-1001 (iadademstat), un inhibiteur puissant de KDM1A en clinique développement pour le traitement des maladies oncologiques. La chimioprobe a un IC50 pour KDM1A de 120 nM et comprend une moiety de liaison FAD liée à un polyéthylène glycol biotinylated (PEG)-queue. La chimioprobe se lie exclusivement au KDM1A libre, mais pas au KDM1A lié par l’inhibiteur dans l’échantillon. Après la liaison de chemoprobe, les complexes de KDM1A contenant dans l’échantillon sont capturés sur des plaques de microtiter avec la surface enduite de streptavidin pour déterminer KDM1A libre, ou sur des plaques enduites d’un anticorps de capture anti-KDM1A monoclonal pour déterminer kDM1A total. Après le lavage, les deux plaques sont incubées avec un anticorps anti-KDM1A de détection, lavées encore, et incubées avec un anticorps anti-lapin d’igG d’âne HRP-conjugué secondaire pour la détection utilisant un substrat luminescent et la quantification en mesurant le relatif d’unités légères (RLU) dans un luminomètre (Figure 1).
Figure 1. Schema of ELISA Enzyme linked chemoprobe immunoabsorbent as for KDM1A target engagement: A) Determination of total KDM1A using sandwich ELISA and B) Determination of free KDM1A using chemoprobe ELISA. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Une courbe standard est incluse dans les deux plaques ELISA pour vérifier la linéarité de chaque analyse. La détermination de l’engagement cible de KDM1A dans chaque échantillon est ensuite calculée comme valeur relative à l’échantillon pré-dose ou véhicule traité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici a été développé pour mesurer directement l’engagement cible De KDM1A à l’aide d’un nouveau ELISA basé sur la capture de chimioprobe KDM1A. La méthode a été validée sur des lignées cellulaires humaines cultivées et des échantillons ex vivo de l’homme, du rat et de la souris et du babouin (y compris les PBMC, les poumons, le cerveau, la peau, les tumeurs), mais peut être facilement appliquée à d’autres espèces dans lesquelles l’anticorps KDM1A cible épitopes et catalytique cent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, et partiellement appuyé par le programme de collaboration CIIP-20152001 et RETOS RTC-2015-3332-1.
Materials
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T. ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia. Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).
- Sugino, N. A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).
- Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms. Blood. 126, 601 (2015).
- Jutzi, J. S., et al. LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone. HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).
- Mohammad, H. P. DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).
- Rivers, A., et al. RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model. Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).
- Rivers, A. Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons. Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).
- Buesa, C., et al. The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation. Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905 (2015).
- Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1. Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).
- Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).
- Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. , (2016).
- Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Rodriguez-Suarez, R. Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).
- Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1. Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).
- Schulz-Fincke, J. Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation. European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).
- Ishii, T., et al. CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens. Scientific Report. 7, 13000 (2017).
- Maes, T. ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192 (2017).
