Summary
Multiplex fluorescerande immunohistokemi är en framväxande teknik som möjliggör visualisering av flera celltyper inom intakt formalin-fast, paraffin inbäddade (FFPE) vävnad. Presenteras är riktlinjer för att säkerställa en lyckad 7-Color multiplex med instruktioner för att optimera antikroppar och reagenser, förbereda diabilder, design och tips för att undvika vanliga problem.
Abstract
Mikromiljö utvärdering av intakt vävnad för analys av cell infiltration och rumslig organisation är avgörande för att förstå komplexiteten i sjukdomsprocesser. De princip tekniker som tidigare använts inkluderar immunohistokemi (IHC) och immunofluorescens (IF) som möjliggör visualisering av celler som en ögonblicksbild i tid med mellan 1 och 4 markörer. Båda teknikerna har brister inklusive svårighet färgning dåligt antigena mål och begränsningar i samband med kors arter reaktivitet. IHC är pålitlig och reproducerbar, men den typ av kemi och tillit till det synliga ljuset spektrumet gör det möjligt för endast ett fåtal markörer som ska användas och gör Co-lokalisering utmanande. Användning av om breddar potentiella markörer men vanligtvis förlitar sig på fryst vävnad på grund av den omfattande vävnad autofluorescence efter formalin fixering. Flödescytometri, en teknik som möjliggör samtidig märkning av flera epitoper, upphäver många av bristerna i IF och IHC, men behovet av att undersöka celler som en enda cellsuspension förlorar den rumsliga kontexten av celler kasta viktiga biologiska Relationer. Multiplex fluorescerande immunohistokemi (mfIHC) broar dessa tekniker möjliggör multi-epitop cellulära fenotypning i formalin fast paraffin inbäddade (FFPE) vävnad samtidigt bevara den övergripande mikromiljö arkitektur och rumsliga förhållandet mellan celler i intakt ostörd vävnad. Hög fluorescerande intensitet fluoroforer som kovalent bindning till vävnaden epitop möjliggör flera tillämpningar av primära antikroppar utan att oroa sig för artspecifika korsreaktivitet av sekundära antikroppar. Även om denna teknik har visat sig producera pålitliga och korrekta bilder för studier av sjukdom, processen för att skapa en användbar mfIHC färgning strategi kan vara tidskrävande och krävande på grund av omfattande optimering och design. För att göra robusta bilder som representerar korrekta cellulära interaktioner på plats och för att mildra optimerings perioden för manuell analys, presenteras här är metoder för bild beredning, optimering av antikroppar, multiplex design samt fel vanligt förekommande under infärgningsprocessen.
Introduction
Visualisering av en intakt tumör mikromiljö (TME) är viktigt att utvärdera inte bara cellulära infiltration i fasta maligniteter men cell till cell interaktioner samt. Multiplex fluorescerande immunohistokemi (mfihc) har vuxit fram som ett effektivt verktyg för multi-antigen fenotypning av celler i studiet av cancer och tillhörande sjukdomar1,2,3,4, 5,6,7. Detta, i kombination med ny programvara och program som utformats för att analysera stora datamängder, möjliggör observation av komplexa interaktioner mellan cellerna1,2,4. Den hastighetsbegränsande faktorn vid datainsamling är ofta kvaliteten på den färgade vävnaden före analysen.
Tidigare tekniker som används för att fenotyp celler i TME inkluderar immunohistokemi (IHC), immunofluorescens (IF) och flödescytometri alla som uppvisar betydande begränsningar. IHC använder formalin fast paraffin inbäddade (FFPE) vävnad sektioner som är deparaffinized och rehydreras innan de färgas av oftast en antikropp. Användning av pepparrots peroxidas (HRP) bunden sekundär antikropp och en kemisk reaktion möjliggör visualisering av en enda antigen epitop8. Medan IHC är tillförlitlig och utförs på FFPE vävnad som är lätt att arbeta med, begränsningar av synligt ljusspektrum innebär endast en eller två markörer kan vara tillförlitlig framstående och colocalization av antigener ganska svårt8. Ett sätt att expandera tillgängliga markörer och därför antigener som kan sonderade på en enda sektion är att byta till fluorescens som möjliggör användning av ett bredare spektrum av det visuella spektrumet. För om, fryst eller FFPE vävnad överförs till diabilder och antikroppar som konjugeras till olika fluoroforer. Även om detta ökar antalet antigener som kan probed, det finns flera viktiga begränsningar. Först, eftersom varje antikropp vanligtvis bara har en fluorophore bifogas, ljusstyrkan är ofta inte tillräckligt stark för att övervinna vävnad autofluorescence. Det är av denna anledning, de flesta om utförs på fryst vävnad som är dyrt att lagra och svårt att arbeta med. Ett begränsat antal fluorescerande taggar är tillgängliga för användning på grund av spektralöverlappning och kors arter reaktivitet, särskilt när icke-konjugerade antikroppar används. Flödescytometri, som består av färsk vävnad bearbetning till en enda cellsuspension och märkning med fluorescerande antikroppar har varit den gyllene standarden för immunfenotypning i årtionden9,10. En fördel med flödescytometri är förmågan att märka flera antikroppar utan oro för Art Cross reaktivitet eftersom de flesta är konjugerade. Eftersom cellerna är "visualiseras" av en maskin och inte mänskliga ögon, det finns mycket mer fluoroforer tillgängliga men detta kommer med en kostnad. Ersättning måste göras manuellt som avsevärt kan förändra resultat som producerar falskt positiva och negativa populationer. Den mest betydande begränsningen av flödescytometri är att vävnads arkitektur och därefter all rumslig information förloras av nödvändigheten för encells suspension.
Multiplex fluorescerande immunohistokemi (mfIHC) med hjälp av en automatiserad fluorescerande Mikroskop i kombination med ny programvara kombinerar fördelarna med IHC, om och flödescytometri genom att tillåta multi-antigen vävnad färgning med signal förstärkning och bibehållande av rumsliga förhållanden utan behov av kompensation. FFPE-vävnad placeras på laddade diabilder som efter antigen hämtning genomgår en omgång primär antikropps applikation till målantigenen av intresse följt av en sekundär antikropp med en kemiskt märke av HRP, liknande IHC. Efter placeringen av den sekundära antikroppen, en HRP specifik reaktion resulterar i en fluorophore kovalent bindning till epitop av intresse11. När vävnaden är märkt, en annan runda av värme bilderna är klar att ta bort den tidigare applicerade primära och sekundära antikropp komplex lämnar endast fluorescerande tagg bunden till vävnaden epitop11. Detta gör att flera antikroppar av alla arter som skall appliceras på nytt utan oro för korreaktivitet11,12. För att minimera alla behov av manuell kompensation av flera fluorescerande färgämnen, en samling av fluoroforer med liten spektralöverlappning inklusive en nukleär motverka fläcken används för att slutföra mfIHC. För att redogöra för autofluorescence stött på FFPE vävnad, programvara subtrafrar autofluorescence från den slutliga bilden med hjälp av en bild från en tom bild som är möjlig på grund av styrkan av antigen specifik fluorescens efter fluorophore signal förstärkning. Med hjälp av nya program som utformats för stora datamängder kan cell platser identifieras och analyseras för rumslig kontext1,2,4. Den mest betydande begränsningen av denna teknik är optimerings tid. En detaljerad metod med instruktioner för experimentell design och färgning och avbildning strategi finns här. mfIHC kommer att vara användbart för laboratorier som för närvarande inte har ett optimerat automatiserat infärgnings system som skulle vilja bättre förstå den rumsliga kontexten av cell-till-cell interaktioner i intakt FFPE vävnad med hjälp av den manuella tekniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt arbete har godkänts av University of Michigans interna granskningsnämnd.
1. optimera primära antikroppar och skjut preparatet
- Bestäm idealisk koncentration av antikroppar för multiplex med konventionell IHC.
- Testa antikropparna för multiplex genom manuell konventionell immunohistokemi (IHC)13.
- Använd specifika vävnader som har en riklig celltyp för varje antikropp som testats, såsom att använda tonsill vävnad för CD3 antikroppar testning.
- Använd referens koncentrationen för IHC som rekommenderas av företaget och slutför sedan IHC med antikroppskoncentrationer vid de rekommenderade koncentrationerna samt koncentrationer över och under den rekommenderade koncentrationen.
- Förbered formalin fast paraffin inbäddad vävnad på diabilder.
- Med en mikrotom, skurna block av FFPE vävnad vid en tjocklek mellan 4 och 6 μm och tillämpas på laddade diabilder.
Obs: med destillerat vatten säkerställer korrekt vävnads montering och följsamhet i hela multiplex. - Placera bilderna platt, vävnad sida upp, och låt torka vid 37 ° c över natten.
- Förvara diabilder i en bildruta bort från extrem temperatur tills du är redo att slutföra multiplex.
- Med en mikrotom, skurna block av FFPE vävnad vid en tjocklek mellan 4 och 6 μm och tillämpas på laddade diabilder.
2. allmän färgningsmetod
- Beredning av tvätt-och antigen återvinningslösningar
- Bered tvättlösningen på 0,1% TBST genom att blanda 9 L avjoniserat vatten, 1 L Tris buffrad saltlösning (TBS) och 10 mL polysorbat 20.
- Bered båda lösningarna för antigen hämtning (pH 6 och pH 9; Tabell över material) genom spädning till 1x med avjoniserat vatten.
- Deparaffinization och rehydrering
- Baka diabilder, liggande plant, vävnad sida upp vid 60 ° c för 1 h i en hybridisering ugn1. Ta bort diabilder från ugnen och låt svalna i minst 5 − 10 min och placera den i ett vertikalt glid rack.
- Behandla bilderna i följande lösningar sekventiellt: xylen i tre exemplar, följt av en enda behandling av 100% etanol, 95% etanol, och slutligen 70% etanol för 10 min vardera med en bild färgning set1.
- Tvätta rack av diabilder för 2 min med avjoniserat vatten genom nedsänkning i en plast Slide Box följt av fixering genom nedsänkning i en plast bildruta fylld med neutral buffrad formalin för 30 min13. Tvätta bilderna i avjoniserat vatten i 2 minuter och fortsätt sedan till antigen hämtning.
- Antigen hämtning
- Placera rack av diabilder i en värmetålig låda fylld till den inre linjen (ca 300 mL) med pH 6 eller pH 9 antigen hämtningsbuffert.
Anmärkning: antigen hämtningsbuffert kan vara antingen pH 6 eller pH 9 som kan behöva optimeras per epitop. Men börja med att använda pH 9 för antikroppar som binder till nukleära epitoper och pH 6 för alla andra antikroppar. - Täck boxen med plastfolie och Använd ett gummiband för att säkra. Placera lådan i mikrovågsugnen vid kanten av den roterande plattan (mikrovågsugn måste utrustas med inverter teknik för jämn uppvärmning). Värm bilderna för 45 s vid 100% effekt följt av 15 min vid 20% effekt13.
Observera: mikrovågbehandling kan behöva optimeras beroende på vilken mikrovågsugn som används. - Låt bilderna svalna i ca 15 − 20 minuter.
- Placera rack av diabilder i en värmetålig låda fylld till den inre linjen (ca 300 mL) med pH 6 eller pH 9 antigen hämtningsbuffert.
- Förbered arbetslösningar av antikroppar och fluoroforer medan glider sval.
- Bered den primära antikropps spädningsvätskan genom att lösa upp 0,5 g bovint serumalbumin granulat till 50 mL TBST. Alternativt, Använd 50 mL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att lösa upp granulat.
- Gör varje primär antikropps lösning till den optimerade koncentrationen fastställd i avsnitt 1, i den primära antikropps spädningsvätskan. Beräkna cirka 200 μL per bild.
- Bered fluorofores arbetslösning genom att späda varje fluorophore i fluorophore-spädningsvätskan till en koncentration av 1:100.
Obs: Detta kan behöva optimeras beroende på antikroppen. Beräkna cirka 100 μL per bild. - På den sista dagen av färgning, förbereda 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) arbetslösning genom att lägga till 3 droppar av DAPI i 1 mL TBST.
- Skjut färgning (tvättning och blockering)
- Ta bort lådan från mikrovågsugnen efter kylning och ta av plastfolie, tvätta bilderna med avjoniserat vatten för 2 min följt av en 2 min tvätta i en plast Slide box fylld TBST13.
- Efter torkning varje bild runt vävnaden med en delikat uppgift torka noga med att inte låta vävnaden torka ut, spåra runt utsidan av vävnaden med hjälp av en hydrofoba barriär penna. Vidrör inte vävnaden med den ömtåliga uppgiften torka eller penna.
- Placera varje bild i den fuktade kammaren och tillsätt blockerande lösning (cirka 4 droppar) till vävnaden. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Bild färgning (primär antikropps applikation)
- Ta varje bild och ta bort blockerande lösning genom att knacka på sidan av bilden på en bunt pappershanddukar och med hjälp av en delikat uppgift torka att ta bort överskjutande blockerande medel från runt vävnaden.
- Lägg tillbaka bilden i den fuktade kammaren och tillsätt cirka 200 μL av den arbetande primära antikroppen. Inkubera i den fuktade kammaren i 1 h vid RT.
- Tvätta med TBST i 2 min genom nedsänkning i tre exemplar13.
Obs: efter varje tvättsteg, ändra TBST kommer att bidra till en renare bild.
- Bild färgning (sekundär antikropps applikation)
- Dabba av återstående TBST från varje bild och applicera cirka 3 till 4 droppar sekundär antikropp (blandning av sekundära HRP-konjugerade antikroppar från kanin och mus). Inkubera i 10 minuter i den fuktade kammaren vid RT13.
Obs: om du planerar att använda en primär antikropp som kräver en annan sekundär antikropp än mus eller kanin eller väljer att använda en alternativ sekundär antikropp, ska du tillämpa lämplig HRP-konjugerad sekundär till diabilderna och inkubera vid RT för 45 min. optimering av Inkubationstiden kan behövas för alternativa sekundära14. - Efter inkubering, tvätta med TBST i 2 min i tre exemplar13.
- Dabba av återstående TBST från varje bild och applicera cirka 3 till 4 droppar sekundär antikropp (blandning av sekundära HRP-konjugerade antikroppar från kanin och mus). Inkubera i 10 minuter i den fuktade kammaren vid RT13.
- Bild färgning (fluorophore ansökan)
- Applicera ca 100 μL av fluorofores arbetslösning och inkubera i den fuktade kammaren vid RT för 10 min13.
- Tvätta med TBST i 2 min i tre exemplar13.
- Avlägsnande av antikroppar
- Mikrovågsugn diabilder (45 s på 100% sedan 15 min vid 20%) i den värmetåliga boxen (se steg 2.3.2) för avlägsnande av antikroppar13,14.
Obs: detta fullbordar en omgång av multiplex. Detta är den enda punkt där protokollet kan pausas. För att pausa protokollet, lämna bilderna nedsänkt i antigen hämtningsbufferten över natten vid rumstemperatur.
- Mikrovågsugn diabilder (45 s på 100% sedan 15 min vid 20%) i den värmetåliga boxen (se steg 2.3.2) för avlägsnande av antikroppar13,14.
- Fortsätt med ytterligare färgomgångar. Upprepa steg 2.5.1 − 2.9.1 för resten av antikropp-fluorophore-paren. När alla antikroppar och fluorofomedel har använts, gå vidare till avsnitt 2,11.
- DAPI-program och montering
- Efter den sista infärgnings rundan i multiplex, ta bort den sista antikropps applikationen med antigen hämtnings lösning pH 613. Tvätta med avjoniserat vatten följt av TBST i 2 min vardera13.
- Applicera ca 150 μL av den arbetande DAPI-lösningen på diabilder och inkubera i den fuktade kammaren i 10 min vid RT1.
- Tvätta med TBST för ca 30 s och montera täckband med en AntiFade Mountant. Applicera klart nageln i de fyra hörnen av täckglan när monteringsmedia har torkat för att säkra täckslip (tillval).
3. Detaljer för bibliotek, monoplexes och multiplex
- Välj bilder för att skapa ett fluorophore-bibliotek.
- För en 7-Color multiplex samla 7 immunceller rik vävnad diabilder (dvs., tonsill, mjälte, etc.) för biblioteket.
ANMÄRKNINGAR: Välj kontroll bilder som ska användas för ett fluorophore bibliotek med varje bild som representerar varje unik fluorofore som kommer att användas i multiplex. Kontroll bilder bör ha en riklig epitop val och kan vara samma typ av vävnad för varje fluorophore.
- För en 7-Color multiplex samla 7 immunceller rik vävnad diabilder (dvs., tonsill, mjälte, etc.) för biblioteket.
- Fläcken och avbilda Arkiv glidbanor för bruk med monoplexes och multiplexes.
- Följ stegen 2.1 − 2.9.1 med hjälp av kontroll bilderna och kontrollera vävnadens diabilder. Placera en annan fluorophore på varje bild med en koncentration av 1:100; en bild bör endast innehålla DAPI.
- Fortsätt till avsnitt 2,11 utom utelämna DAPI-färgning och Använd istället TBST och montera enligt beskrivningen.
- Efter att låta bilder torr över natten, bild med alla kanaler DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas röd, halvledare kvantprickar, och fluorescein isotiocyanat (FITC) ställa in exponeringen för 250 MS med mättnadsskydd funktionen1.
Obs: exponeringstiderna kan ställas in till 50 − 250 MS13. - Ladda upp biblioteket bilder på programvaran och använda i analysen av monoplexes och multiplex.
- Välj diabilder för monoplexes.
- Välj kontroll bilder som har en riklig epitop val baserat på optimerade antikroppar (avsnitt 1). För varje omgång av färgning som ska göras i multiplex, Välj det antalet kontroll bilder för att skapa monoplexes.
Obs: Syftet med monoplex är att bestämma den bästa positionen (ordning) för varje antikropp som ska användas i multiplex.
- Välj kontroll bilder som har en riklig epitop val baserat på optimerade antikroppar (avsnitt 1). För varje omgång av färgning som ska göras i multiplex, Välj det antalet kontroll bilder för att skapa monoplexes.
- Fläcken monoplexes.
- Följ avsnitten 2.1 − 2.11 med den primära antikroppen vid en annan ordning (position) för var och en av bilderna. Varje bild bör bara ha en primär antikropp som appliceras på en order (position) som skiljer sig från de andra bilderna.
Anmärkning: för varje bild där rundan inte kräver någon primär antikropp eller fluorophore, Använd istället primär antikropp spädningsmedel och fluorophore spädningsvätska13.
- Följ avsnitten 2.1 − 2.11 med den primära antikroppen vid en annan ordning (position) för var och en av bilderna. Varje bild bör bara ha en primär antikropp som appliceras på en order (position) som skiljer sig från de andra bilderna.
- Bild bilder och analysera monoplex.
- Använda mikroskopet och ställa in exponeringstiden till 250 MS för alla kanaler fånga varje bild använder DAPI att fokusera.
Obs: exponeringstiderna kan ställas in till 50 − 250 MS14. - Använda analysprogramvara utvärdera varje monoplex glida genom att titta på fluorescerande intensitet av den färgade markören.
- Jämför intensiteten med bakgrunden. Om det är minst 5 − 10 gånger högre än bakgrunden, är positionen för den bilden en optimal position att använda i den slutliga multiplex.
- Använda mikroskopet och ställa in exponeringstiden till 250 MS för alla kanaler fånga varje bild använder DAPI att fokusera.
- Välj bilder för multiplex.
- Välj de bilder av intresse och lägga till en extra bild som ska användas som en tom bild för subtraktion av autofluorescence efter färgning och avbildning.
- Fläcken multiplex.
- Baserat på monoplex resultat, Välj lämplig ordning (positioner) för varje antikropp baserat på steg 3.5.3. Tilldela varje fluorophore till en antikropp.
Obs: Detta kan behöva optimering; men planerar att använda ljusa antikroppar för mindre riklig markörer1, Co-localizing antikroppar bör matchas med fluoroforer vid långt spektrum från varandra13, och fluoroforer med spektrumet 540 och 570 bör inte vara co-lokaliserade på grund till spektral överlappning problem1. - Fortsätt med avsnitten 2.1 − 2.11 för att säkerställa att den tomma bilden inte får primär antikropp, fluorophore eller DAPI, Använd istället antikropps spädningsmedel, fluorophore spädningsvätska och TBST respektive i dess ställe.
- Baserat på monoplex resultat, Välj lämplig ordning (positioner) för varje antikropp baserat på steg 3.5.3. Tilldela varje fluorophore till en antikropp.
- Bild multiplex och analysera för integritet färgning
- Använda mikroskopet och ställa in exponeringstiden till 250 MS för alla kanaler, fånga varje bild använder DAPI att fokusera.
- Med hjälp av analysprogram (tabell över material), utvärdera varje multiplex av fluorescerande falsk färg.
Obs: en tydlig bild bör tydligt visa varje markör. Om en markör ser diffus och kornig eller är obefintlig, är det troligt att markören inte fungerade och behöver optimeras igen. - Med hjälp av analysprogramvara, utvärdera varje multiplex av patologi vy. Patologi Visa kommer att bekräfta specificiteten hos varje markör. Jämför med IHC som tidigare optimerats (avsnitt 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den övergripande processen för att få en 7-Color multiplex assay följer ett repetitivt mönster. Figur 1 beskriver processen i ett diagramformat. När bilderna skärs och torkas eller tas emot från laboratoriet och bakas i en hybridisering ugn vid 60 ° c för 1 h, sedan gå vidare till avparaffinering och rehydrering, fixa bilderna i formalin igen följt av antigen hämtning. Varje omgång multiplexering börjar vid antigen hämtning och ytbehandlingar vid avlägsnande av antikroppar (figur 1).
Optimering av varje steg i processen är avgörande för att uppnå en tydlig och användbar bild. Antikroppar ska testas av IHC först med antigen hämtningsbuffertar med pH 6 och pH 9 för varje antikropp för att visualisera vilken antigen hämtningsbuffert som fungerar bäst med just den antikroppen. I allmänhet reagerar nukleära mål på antigen hämtning med buffert pH 9. Till exempel, FOXP3 fungerar bäst när antigen hämtning buffert av pH 9 används i motsats till CD3 som fungerar bäst med antigen hämtning buffert av pH 6. Bilder tagna från IHC-processen bör användas för att validera specificiteten hos multiplex-analysen.
En monoplex är nödvändigt att bestämma ordningen för varje antikropp i multiplex. När du använder antingen en 4-eller en 7-färg kit, varje antikropp kommer att ha en önskad ordning i matrisen. För det antal antikroppar som kommer att användas, samla lämplig kontroll diabilder (dvs. för en 7-Color multiplex där en färg är DAPI, Välj 6 vävnads specifika representativa kontroll bilder för de 6 andra fluorofotar). Figur 2 A-C är en schematisk representation av en monoplex analys med 3 diabilder med FFPE tjocktarmscancer vävnad. Varje bild har FOXP3 på en annan plats i matrisen med hjälp av fluorophore 570 som dess tagg. DAPI används som en motfläck för att på ett adekvat sätt visualisera kärnor. I figur 3visas representativa bilder av en monoplex och en multiplex med varierande FOXP3 position. I figur 3A, B där FOXP3 befinner sig på den tredje positionen (motsvarande den ordning som visas i figur 2C), ses specifik och robust färgning av FOXP3 (röd) som framgår av ljus kärn färgning figur 3a och samlokalisering med CD3 figur 3b. Den fluorophore signalintensiteten bekräftar specificiteten hos FOXP3 utan ospecifik färgning någon annanstans i vävnaden figur 3a. I diagram 3c, där FOXP3 befinner sig vid den första positionen (motsvarande beställningen i figur 2A), finns det icke-specifik färgning av FOXP3. Korniga diffusa områden i rött täcker de flesta av bilden och fluorescerande intensitet på dessa områden är mindre än 1. Försöker göra en multiplex utan att fylla i en monoplex först för att testa ordningen på färgning resultat i ett liknande resultat och kommer att slösa reagenser. Ett annat kritiskt steg som inte kan förbises i multiplex processen är DAPI färgning. En fungerande DAPI-motfärgning är grunden för cell identifiering och ytterligare rumslig analys med hjälp av analysprogram varan. En viktig kontrast kan ses i den sammansatta bilden med Working DAPI (blå) i figur 3E och i den icke-arbetande DAPI i figur 3F. Bilden i figur 3F kunde inte användas för att identifiera celler i analysprogram varan. Ett försök att rädda multiplex och vävnads analys, täckglas kanske avlägsnas genom blötläggning bilden i tbst följt av en mikrovågsugnen steg i pH 6 antigen hämtning buffert med en extra tillämpning av DAPI.
När monoplex-analysen har slutförts och optimal antikropps ordning bekräftats kan en multiplex-strategi konstrueras figur 4. För varje mål måste en annan fluorophore väljas. Det antal som är associerat med varje fluorophore representerar ungefär den spektrala fluorescerande våglängd avges efter excitation, liknande flödescytometri. Försiktighet bör iakttas vid matchning av föreslagna antikroppar med fluoroforer för att begränsa spektralöverlappning och potentiell blödning av markörer. En bra strategi är att välja våglängder långt från varandra för co-localizing antikroppar för att minska överskott spektralöverlappning ger en skarp bild och mer tillförlitlig fenotypning13. Till exempel, i multiplex strategi visas (figur 4), är CD8 paras ihop med fluorophore 570 medan CD3 paras ihop med fluorophore 520. Man bör undvika användning av fluorophore 540 och 570 i Co-lokaliserade mål som dessa tenderar att vara den mest odiskriminerande och kan försämra resultaten. Fluorophore 620 tenderar att vara mycket ljus och bör användas för antikroppar som inte är riklig i vävnaden. Ett nyare bibliotek som används som referens för varje fluorofore också stöd för att minska spektralöverlappning av fluoroforer. En tom bild som genomgår alla rundor av antigen hämtning är nödvändigt för att säkerställa autofluorescence extraktion från komposit bilden. Denna tomma bild kommer att genomgå samma behandling som multiplex-bilderna förutom i stället för en fungerande primär antikropp och fluorophore, kommer antikropps spädningsmedlet och fluorophore spädningsmedel att användas respektive figur 4b.
För att säkerställa att multiplex designen fungerade korrekt och markörerna ses i komposit bilden är specifika, Använd "patologi bild" i kombination med "brightfield" inställningsalternativ med hjälp av Mikroskop programvara som skapar en faux IHC bild som sedan kan jämfört med de tidigare IHC-analyserna som diskuterades i avsnitt 1. Tyvärr, vackra sammansatta bilder kanske inte nödvändigtvis återspeglar en korrekt fläck och detta är ett viktigt steg för att kvalitetskontrollera processen och förhindra falskt positiva resultat. Figur 5a visar en sammansatt bild utan initial oro. CD3 visualiseras och visar specifik färgning (grön) och bekräftas av patologi brightfield bild i Figur 5b. CD163 (orange) syns i komposit bilden (figur 5a). men vid utvärderingen av patologi brightfield syn på CD163 (figur 5c), antikroppen är ospecifik. Ett exempel på en optimal multiplex-bild med specifik färgning visas i en sammansatt bild (figur 5D). CD3 och CD163 specificitet bekräftas med hjälp av patologi brightfield Visa (figur 5E och figur 5F, respektive) och jämförs positivt med tidigare IHC-analyser som utförs med dessa antikroppar (visas inte).
Bild 1: Färgnings arbetsflödesdiagram.
Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: utveckling av Monoplex.
(A) tjocktarmscancer Slide med FOXP3 på position 1. (B) tjocktarmscancer Slide med FOXP3 på position 2. (C) tjocktarmscancer Slide med FOXP3 på position 3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: framgångar och fallgropar av monoplex och multiplex.
A) monoplex-analys av primär tjocktarmscancer med FOXP3 vid position 3, visad fluorescerande intensitet. B) multiplex-analys av primär tjocktarmscancer med FOXP3 vid position 3 och CD3 vid position 2. C) monoplex-analys av primär tjocktarmscancer med FOXP3 vid position 1, visad fluorescerande intensitet. (D) multiplex-analys av primär tjocktarmscancer med FOXP3 vid position 1 och CD3 vid position 2. (E) multiplex-analys av primär tjocktarmscancer med ordning av antikroppar enligt följande: CD8 (gul), CD3 (grön), CD163 (orange), pancytokeratin (vit), PD-L1 (magenta), FOXP3 (röd), arbetar DAPI (blå). (F) multiplex-analys av primär tjocktarmscancer med ordning av antikroppar enligt följande: CD8 (gul), CD3 (grön), CD163 (orange), pancytokeratin (vit), PD-L1 (magenta), FOXP3 (röd), icke-arbetande DAPI (blå). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: multiplex utveckling.
(A) multiplex Slide av tjocktarmscancer i en 7-Color multiplex. (B) tomt glida i en 7-Cologne multiplex användande koloncancer vävnad. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: analysera specificitet av en 7-Color multiplex.
(A) multiplex komposit bild med antikroppar enligt följande: CD8 (gul), CD3 (grön), CD163 (orange), pancytokeratin (vit), Ki67 (röd), DAPI (blå). (B) patologi brightfield syn på bild i panel A på CD3 endast Visa. (C) patologi brightfield syn på bild i panel A på CD163 endast Visa. (D) multiplex komposit bild med antikroppar enligt följande: CD8 (gul), CD3 (grön), CD163 (orange), pancytokeratin (vit), PD-L1 (magenta), FOXP3 (röd), DAPI (blå). (E) patologi brightfield syn på bild i panel D på CD3 endast Visa. (F) patologi brightfield syn på bild i panel D på CD163 endast Visa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intakta vävnadsprover från solid tumörbiopsi och kirurgisk resektion förblir viktiga diagnostiska och prediktiva verktyg för sjukdoms analys samt patient prognos. Multiplex fluorescerande immunohistokemi (mfIHC) är en ny teknik som kombinerar fördelarna med immunohistokemi (IHC), immunofluorescens (IF) och flödescytometri. Tidigare metoder för att sond celler in situ har tillåtit för utvärdering av cell-till-cell-arrangemang i en vävnads miljö8, dock, det låga antalet epitoper som kan sonderade begränsar komplex analys. Flödescytometri, även om det är användbart för att analysera många celltyper i ett prov, förlorar rumslig kontext genom att förbereda prover som en enda cellsuspension9,10. mfihc överbryggar dessa tekniker genom att behålla den rumsliga kontexten för den cellulära mikromiljön och öka antalet epitoper som kan märkas samtidigt som signalen förstärks per märkt epitop11. Tidigare forskning har använt mfihc för fenotypning cellinfiltrat i cancer och icke-cancervävnadsprover1,2,3,4,5,15. Post-image analys har också använts för att analysera rumsliga relationer av celler och strukturer inom vävnaden mikromiljö1,2,4. För tillförlitlig analys måste en specifik och korrekt bild först framställas. Den manuella infärgning tekniken, i motsats till ett automatiserat infärgnings system, möjliggör mindre och kostnadsmedvetna laboratorier tillgång till denna teknik. Optimerings tid och infärgnings tid är bland de största hindren för att uppnå en tillförlitlig bild för ytterligare rumslig analys.
Flera allmänna regler ökar sannolikheten för en lyckad generering av en tillförlitlig sammansatt multiplex-avbildning och sparar tid och resurser. Antikroppar som ska användas i multiplex bör väljas baserat på framgång med manuell konventionell IHC. Antigen hämtningsbuffertar med pH 6 och pH 9 bör användas för IHC för att undersöka lämplig antigen hämtning för användning i multiplex. Monoplex utveckling är nödvändig för att identifiera placeringen av antikroppar inom multiplexering protokollet. Motivet för detta är komplicerat och varierar mellan vävnadsprover och epitoper. I vissa fall kan epitopen försämras med flera mikrovågsugnen steg och markör visualisering förloras, vilket ofta är fallet med CD3. FOXP3, men blir ljusare med mer mikrovågsuvnar steg och är knappt synlig om de placeras på första eller andra omgången av multiplex13,14.
Infärgningsprocessen inleds med att FFPE-vävnad skärs på laddade diabilder. Det första problemet som kan uppstå är vävnaden faller bort av bilden efter microwaving. När laddade bilder inte används, är vidhäftning av vävnad till glasytan begränsad och vävnaden kommer att ha antingen överdriven vikning eller kan glida av helt. För att ytterligare säkerställa att vävnaden fastnar på bilderna under infärgningsprocessen, utförs flera tekniker. Först medan skära blocken på diabilder, den renaste formen av vatten fungerar bäst. För vissa laboratorier kan avjoniserat vatten vara tillräckligt men destillerat vatten har fungerat bäst. Bilderna ska torkas platt omedelbart efter kapning vid 37 ° c över natten. För att ytterligare säkerställa följsamhet, är bilderna sedan placeras i en hybridisering ugn och bakade liggande på 60 ° c i en timme strax före användning. Även om formalin fixering redan har inträffat under den inledande vävnad förberedelseprocessen, placera bilderna i neutral buffrad formalin för 30 min efter avparaffinering och rehydrering processen förbättrar den strukturella integriteten hos den monterade vävnad1,13.
Den manuella infärgning processen kan ta upp till tre, 8-timmars dagar beroende på antalet antikroppar som används. Att undvika fallgropar är viktigt för att spara tid och kaliumsparande reagenser. Det första vanliga misstaget uppstår ofta vid REAGENSBEREDNING. Vatten skiljer sig mellan laboratorier och kan vara en enda skillnad i resultat från ett labb till nästa. Att använda samma samt en ren vattenkälla för alla reaktioner och reagenser säkerställer ett jämnt resultat. Antikropparna, blockeringslösningen och fluorofoforer fungerar bäst vid rumstemperatur. För att undvika fallgropar i reagens och beredning av arbetslösning, Använd samma vatten för alla reagenser. Använd även alla arbetslösningar och reagenser i rumstemperatur.
Felsökning av mfIHC är viktigt och efterlevnad av strikta laboratorie riktlinjer avgörande för att begränsa kontaminering av komponenter och/eller operatörsfel. Produktion av suboptimala bilder kommer att skeva resultat och leda till falskt positiva och negativa cellpopulationer som kan negativt påverka data. Eftersom den ultimata analysen vanligtvis innehåller datorgenererade fenotyper baserade på maskininlärning, kan små fel i färgning förstoras för att påverka hela datauppsättningen. Till exempel, även om alla fläckar kan fungera perfekt, ett fel eller utelämnande av DAPI kommer att förhindra framtida cellsegmentering och räkna rendering experimentet värdelös. Analysprogramvara använder DAPI färgning inte bara för att identifiera celler men tilldelar x-och y-koordinater till varje cell och om multiplex har dim, dåligt omskriven, eller diffus DAPI färgning, bilden kan inte användas ytterligare och multiplex måste redone eller försök räddning och omfärgning av DAPI. Användning av programvarukomponenter såsom patologi och brightfield åsikter kommer att öka förtroendet för känslighet och specificitet tidigt i optimeringsprocessen och förhindra misstag tidigt i multiplex processen.
De modifierande aspekterna av avbildningsprocessen kan också hjälpa till med bild optimering. Till exempel tar en bild med DAPI som visuellt hjälpmedel för att fokusera hjälper till att undvika suddiga bilder. Lägga till den nyligen gjorda fluorophore biblioteket till programvaran kommer att säkerställa en ren bild och mindre spektrala överlappning av varje fluorophore under analysfasen och med hjälp av den tomma bilden för att extrahera autofluorescence intensifierar markörer och förbättrar bilden Kvalitet.
Användningen av vävnadsprover har och kommer att förbli ett viktigt verktyg för att utreda patofysiologi av sjukdom. Framväxande teknik har ökat vår förståelse av cell-till-cell interaktioner och mfIHC är en lovande ny aktör. Optimering och noggrannhet under infärgningsprocessen i denna teknik är av största vikt för korrekt användning och ytterligare analys av cell-till-cell interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja tacka Ed stack, tidigare från Perkin Elmer, för hans hjälp med installation och optimering av ursprungliga multiplex färgning. Författarna skulle också vilja tacka kristen Schmidt från Akoya Biosciences för tips med hjälp av analysprogram varan. Forskning som rapporterades i denna publikation stöddes av National Cancer Institutes of Health under tilldelnings nummer P30CA046592, K08CA201581 (TLF), K08CA234222 (JS), R01CA15158807 (MPM), RSG1417301CSM (MPM), R01CA19807403 (MPM), U01CA22414501 (MPM, HC), CA170568 (HC). Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikter som finns hos National Institutes of Health. Ytterligare stöd tillhandahölls av Jeffery A. Colby Colon Cancer och Tom LiU Memorial Research Funds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).
- Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , Perkin Elmer Manual. (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
