Summary
В этой статье мы представляем протокол, который описывается как анализ плавления с высоким разрешением (HRM) на основе целевых индуцированных локальных поражений в геномах (TILLING). Этот метод использует изменения флуоресценции во время плавления дуплекса ДНК и подходит для высокой пропускной связи скрининга как вставки / удаления (Indel) и одной базы субстанции (SBS).
Abstract
Целевая индуцированная локальная поражения в геномах (TILLING) является стратегией обратной генетики для высокой пропускной проверки индуцированных мутаций. Тем не менее, система TILLING имеет меньшую применимость для обнаружения вставки/удаления (Indel) и традиционные TILLING нуждается в более сложных шагах, таких как самоанализ пищеварения CEL I и электрофорез геля. Для повышения эффективности пропускной способностью и отбора, а также для того, чтобы сделать возможным скрининг как Indels, так и отдельных базовых субстанций (SBSs), разработана новая система плавления с высоким разрешением (HRM) tillING. Здесь мы представляем подробный протокол HRM-TILLING и показываем его применение при скрининге мутаций. Этот метод может анализировать мутации ампулконов ПЦР путем измерения денатурации двухцепочечной ДНК при высоких температурах. Анализ HRM непосредственно выполняется после ПЦР без дополнительной обработки. Кроме того, простой, безопасный и быстрый (SSF) метод извлечения ДНК интегрирован с HRM-TILLING для идентификации как Indels, так и SBS. Его простота, надежность и высокая пропускная готовность делают его потенциально полезным для сканирования мутаций в рисе и других культурах.
Introduction
Мутанты являются важными генетическими ресурсами для исследования функциональной геномики растений и разведения новых сортов. Передовой подход к генетике (т.е. от выбора мутантов до клонирования генов или развития разнообразия) был основным и единственным методом использования индуцированных мутаций около 20 лет назад. Разработка нового метода обратной генетики, TILLING (Нацеливание индуцированных местных поражений в геномах) McCallum et al.1 открыл новую парадигму, и с тех пор она была применена в большом количестве животных и растений видов2. TILLING особенно полезен для размножения, которые технически трудно или дорого определить (например, устойчивость к болезням, содержание минералов).
TILLING был первоначально разработан для мутаций точек скрининга, индуцированныххимическими мутагенами (например, EMS 1,3). Она включает в себя следующие шаги: создание TILLING населения (ы); подготовка ДНК и объединение отдельных растений; ПЦР усиление фрагмента ДНК-мишени; формации гетеродплексов путем денатурации и аннулирования ампулктонов ПЦР и расщепления с помощью cel I nuclease; и идентификация мутантов и ихспецифических молекулярных поражений 3,4. Тем не менее, этот метод по-прежнему является относительно сложным, отнимает много времени и низкой пропускной их. Чтобы сделать его более эффективным и с более высокой пропускной их, многие модифицированные методы TILLING были разработаны, такие как удаление TILLING (De-TILLING) (Таблица 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
Анализ кривой HRM, который основан на изменениях флуоресценции во время плавления дуплекса ДНК, является простым, экономичным и высокопроизводительным методом для скрининга мутаций и генотипирования13. HRM уже широко используется в исследованиях растений, включая HRM на основе TILLING (HRM-TILLING) для скрининга мутаций SBS, индуцированных EMS mutagenesis14. Здесь мы представили подробные протоколы HRM-TILLING для скрининга мутаций (как Indel, так и SBS), индуцированных гамма-лучами в рисе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
-
Развитие мутагенизированных популяций, связанных с лучами,
- Лечить около 20 000 сушеных семян риса (с содержанием влаги около 14%) рисовой линии японики (например, DS552) с 137С гамма-лучей при 100 Ги (1 Г/мин) в объекте облучения (например, гамма-клетка).
ПРИМЕЧАНИЕ: Семена, используемые для лечения должны иметь высокую жизнеспособность (например, с частотой прорастания Доза облучения риса индика может быть увеличена до 150 Ги. - Посеять облученные семена после прорастания на саженец и пересадить саженцы индивидуально на рисовое поле и вырасти в m1 населения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прямое посев М1 растений редко может быть применен для экономии затрат на рабочую силу. Предотвращение перебора растений M1 с другими сортами риса с использованием средств физической или биологической изоляции. - Массовый урожай M2 семян из M1 растений, с 1-2 семена от каждого M1 паники, чтобы сформировать M2 населения.
ПРИМЕЧАНИЕ: На практике и для простоты, урожай все семена Растений М1 и после полного смешивания, часть берется для формирования M2 населения. - Замочите около 5000 М2 семян в воде для 24 (Индика рис)-36 (japonica рис) ч при комнатной температуре. Затем дайте семенам прорасти при 37 градусах По Цельсия в течение 2 дней на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Больше семян M2 может быть прорастано для анализа, чтобы увеличить вероятность выявления мутантов. - Поместите проросшие семена в посевные панели с небольшими отверстиями и выращивайте их гидропонно в течение 3-4 недель в культурном растворе, модифицированном из Yoshida et al.15 в стеклянной будке с фотопериодом 12 ч (дневной (30 х 2) КК и ночью (24 х 2) КС.
- Лечить около 20 000 сушеных семян риса (с содержанием влаги около 14%) рисовой линии японики (например, DS552) с 137С гамма-лучей при 100 Ги (1 Г/мин) в объекте облучения (например, гамма-клетка).
- Выборка листовых тканей: Вырезать один диск (2 мм) из полностью расширенного листа каждого посева в том же положении с помощью отверстия перфоратор.
-
Подготовка решений для экстракции ДНК
- Буфер A: Добавить 2 мл 5 M NaOH и 10 мл 20% Tween 20, чтобы сделать окончательный объем 50 мл. Свежеприготовленный буфер А перед извлечением ДНК.
- Буфер B: Добавить 20 мл 1 M Tris-HCl (pH 8.0) и 80 л 0,5 М EDTA, чтобы сделать окончательный объем 100 мл.
-
ПЦР праймеры
- Праймеры для анализа HRM: Дизайн праймеров для усиления целевой последовательности с помощью программного обеспечения (например, Primer Premier5) и синтезировать коммерческой компанией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что HRM менее применима к анализу длинных фрагментов, и, следовательно, ампликоны должны быть меньше 400 bp. Фрагменты со слишком высокими (Яgt;75%) или слишком низко (злот;25%) Содержание GC также не хорошо подходит для анализа HRM. - Праймеры для контроля качества: Используйте 24 Маркеры SSR, распределенные по 12 рисовым хромосомам из Пэн и др.16.
- Праймеры для анализа HRM: Дизайн праймеров для усиления целевой последовательности с помощью программного обеспечения (например, Primer Premier5) и синтезировать коммерческой компанией.
2. Извлечение ДНК
- Поместите 4 листовых диска в каждую скважину 96-хорошей пластины ПЦР, добавьте буфер A раствор (50 мл/хорошо). Заморозить тарелку в морозильной камере -80 градусов в течение 10 минут.
- Разморозить тарелку при комнатной температуре, а затем инкубировать при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
- Добавьте 50 кЛ буфера B к каждой скважине и хорошо перемешайте путем вихря.
- Центрифуга пластины в течение 1 мин на 1500 х г. Супернатант готов к ПЦР.
3. Усиление ПЦР
-
Оптимизация ПЦР
- Добавьте следующие реагенты к каждому ПЦР хорошо: 1 кЛ ДНК (супернатант в шаге 2.4), 5 qL 2x Master Mix (содержащий 2x PCR буфер, 4 ммоль / L MgCl2, 0,4 ммоль / л 2'-deoxyribonucleoside трифосфаты (dNTPs), и 50 U/mL Taq полимерДНК, каждый nomol /L праймеры, и сделать окончательный объем до 10 л с использованием нуклеаза свободной воды.
- Используйте градиент-способный тепловой блок для определения оптимальной температуры annealing для каждого целевого фрагмента с помощью следующей программы ПЦР: 5 мин при 94 градусах по Цельсию, затем 40 циклов по 30 с при температуре 94 градусов по Цельсию, 30 с при температуре 52-62 градусов по Цельсию и 30 с при температуре 72 градусов по Цельсию , с окончательным расширением при 72 градусах по Цельсию в течение 8 мин и удержанием при 16 градусах Цельсия.
- Изучите ампелоны на 1% гелей агарозы для определения оптимальной температуры аннулирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная температура аннулирования должна позволить специфическое усиление целевого фрагмента, без неспецифического усиления и грунтового димеризации.
-
ПЦР для анализа HRM
ПРИМЕЧАНИЕ: HRM совместимые пластины и ДНК Саженцы M2 извлечены, как описано в шаге 2.4 используются для ПЦР.- Выполняйте ПХР в окончательном томе в 10 зл, с 1 зл ДНК (супернатант), 5 Зл 2x Master Mix, 0,2 л каждый из 10 ймоль / L праймеров, и 1 Л 10x флуоресцентный краситель. В каждую пластину входит один дикий тип (WT) родительский образец и один отрицательный (без ДНК) контроль.
- Добавьте каплю минерального масла в каждую скважину, чтобы предотвратить испарение.
- Запечатайте тарелку клейкой пленкой и центрифугой при 1000 х г в течение 1 мин.
- Запустите ПЦР, используя оптимизированную температуру аннулирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях, флуоресценция краситель может повлиять на усиление ПЦР, следовательно, краситель добавляется после завершения ПЦР. В таких случаях краситель включается в нити ДНК путем денатурирования и аннулирования.
4. HrM сканирование и подтверждение мутации
- Снимите клейкую пленку с пластины и вставьте пластину в HRM-машину.
- Выберите New Run из меню файлов или нажмите кнопку «Запуск» в верхней части экрана.
- Укажите начальные и окончание температуры для расплава от 55 градусов по Цельсию до 95 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: После первого запуска, диапазон температуры расплава может быть определен для конкретного фрагмента; следовательно, температура расплава может быть скорректирована для последующего анализа того же фрагмента, чтобы сэкономить время. - Выберите образцы для анализа плавления с высоким разрешением, исключите образцы, аналогичные отрицательному контролю.
- Нормализуйте плавящиеся кривые, чтобы иметь то же начало и окончание флуоресценции. Визуально подтвердите, что курсоры температуры Нижнего Мина и Нижнего Макса находятся в области кривых.
- Держите уровень «F» (разница флуоресценции) при настройке по умолчанию 0,05.
- Выберите Общий и Вариант из списка выбора стандартов и выберите нормальную чувствительность.
- Используйте WT в качестве элемента управления; образцы со значением ВТ в размере 0,05 фунтов, считаются содержат растения-мутанты.
-
Идентификация и подтверждение растений-мутантов.
- Определите четыре растения, из которых был сделан каждый бассейн мутантов.
- Извлекайте ДНа от каждого из этих заводов используя метод CTAB согласно Allen et al.17 с некоторыми изменениями.
ПРИМЕЧАНИЕ: DNase-бесплатно RNase и NaAc не используются при извлечении ДНК с помощью метода CTAB, описанного Аллен и др.17, как качество ДНК достаточно хорошо для дальнейшего усиления ПЦР. Отрегулируйте ДНК до конечной концентрации в 25 нг/Л после количественной оценки с помощью спектрофотометра. - Увеличьте целевой фрагмент с помощью праймеров ПЦР и программируйте так же, как и для анализа HRM.
- Определите специфические молекулярные поражения sanger sequencing ампиконов.
ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения усиления ПЦР, отправить ампликоны в компанию для секвенирования Sanger. Молекулярное поражения можно определить, сравнив последовательности между заводом М2 и WT.
5. Контроль качества выбранных мутантов с помощью молекулярных маркеров
- Выполните ПЦР для 24 маркеров SSR в окончательном объеме 10 зЛ с 25 нг геномной ДНК (извлеченных с использованием протокола CTAB), 5 qL 2x мастер смеси, 0,2 л каждого из 10 мкм SSR праймеров.
- Запуск ПЦР с использованием следующей программы: 5 мин при 94 градусах по Цельсию, затем 30 циклов 30 с при 94 градусах По Цельсию, 30 с при 55 градусах По Цельсию и 30 с при 72 градусах По Цельсию, с окончательным расширением при 72 градусах по Цельсию в течение 7 мин.
- Разделите ампликоны на 8% гелей полиакриламидида и выявить полиморфизм усиленных фрагментов на серебристое окрашивание18.
- Сравните гаплотипы SSR выбранных вариантов и WT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Индуцированные мутанты часто имеют гаплотипы SSR идентичны их WT, если больше чем одно маркеры SSR друг между вариантом и WT, вариант высок правоподобный для того чтобы быть генетическим contaminant (например, смесь или outcrossed завод) довольно чем наведено мутант18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сканирование и анализ HRM
В общей сложности было произведено 1140 объединенных образцов ДНК из 4560 м2 саженцев, которые подверглись усилению ПЦР. Два фрагмента размером 195 б.п. и 259 б.п. были усилены для OsLCT1 и SPDTсоответственно (таблица2). В большинстве образцов были кривые плавления, не сильно отличающиеся от WT (ЗФ Злт; 0,05). КРИвые HRM, значительно отличаемые от WT (ЗФ, 0,05) были сгруппированы с цветом (ы) отличаются от WT программным обеспечением(рисунок 1).
Подтверждение мутации и частота
Для усиления был использован образец ДНК отдельного саженца, и соответствующий фрагмент был секвенирован. Тип мутации и положение генов могут быть подтверждены секвенированием хроматограмм(рисунок2). Три мутации, включая два Indels и один SBS были выявлены из 4560 М2 саженцы (таблица 2). Было установлено, что все три части мутанта были гетерозиготными в месте мутации(рисунок 2).
Частота мутаций здесь называют частотой мутации, произошедшей в геноме в популяции TILLING. На основе формулы ниже было установлено, что частота мутации составила около 1/690 кб.
Рисунок 1: HRM-TILLING M2 Рассада для мутаций в OsLCT1 (A, B) или SPDT (C) Гены. Дикий тип был выбран в качестве эталона для развития кривых разницы флуоресценции. Мутанты показали значительно разные кривые HRM с qFs s s; 0.05 при температурах 90.0-92.0 C и 81.5-83.5 C, соответственно. Эта цифра была изменена с Li et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Секвенирование хроматограмм целевых фрагментов мутантов. Прямоугольная коробка указывает на гетерозиготный участок с мутацией G'A науровне 4304 б.п. OsLCT1 (A); один нуклеотид A вставки на 4240 bp OsLCT1 указывается стрелка (B); и удаление тринуклеотида TTC в положении 5948-5950 bp SPDT указываетсячерной линией (C ). Эта цифра была изменена с Li et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Сокращение | Полное имя | Преимущества или применимость | Недостатки | Ссылки |
| Традиционный TILLING | Ориентация на индуцированные локальные поражения в геномах | Для мутаций точек скрининга | Затраты на время и затраты | МакКаллум и др., 2000; Тилль и др., 2003 |
| Эко-ТИЛЛИНГ | Экотип-ТИЛЛИНГ | Для скрининга мутаций в естественных популяциях | Дорогостоящая и низкая чувствительность | Комаи и др., 2004 |
| Де-ТИЛЛИНГ | Удаление TILLING | Для большого скрининга удаления | Сильно зависит от хорошей системы ПЦР | Роджерс и др., 2009 |
| iTILLING | Индивидуальный TILLING | Идентификация мутаций с использованием персонализированных популяций TIILLING | Не постоянное население | Буш и Крисан, 2010 |
| DHPLC-ТИЛЛИНГ | Денатурирование высокопроизводительной жидкой хроматографии на основе TILLING | Экономия времени | Низкая пропускная их пропускная высохла | Colasuonno et al., 2016 |
| Сек-ТИЛЛИНГ | TILLING путем секвенирования | Высокая пропускная связь, неферментативная система | Относительно дорогостоящий и более высокий ложноположительный | Цай и др., 2011; Кумар и др., 2017 |
| HRM-TILLING | Таяние высокого разрешения-TILLING | Высокая пропускная их пропускная их часть и экономия времени; Неэнзиматическая система | Предел длины фрагмента ПЦР | Dong et al., 2009; Гади и др., 2009 |
Таблица 1: Преимущества и недостатки различных подходов TILLING.
| Имя гена | Джин Лочи | Функция гена | Последовательность праймер (5'-3') | ТМ после оптимизации (КК) | Размер продукта (bp) | Количество мутаций (тип мутации) | ||
| OsLCT1 | ЛОК-Ос06g38120 | Низкий транспортер кадмия | LCT-F: CTCGATGTTAAGCATGCTCC LCT-R: AGAGTCAGGACGGCGCTAC | 61 | 195 | 2 (переход G-A, вставка 1 bp) | ||
| СПДТ | ЛОК-Ос06g05160 | SULTR-подобный фосфорный распределительный транспортер | СПДЦ-Ф: TTCTCGGGTAAT SPDT-R: CCACGCATCTCTGGTTACAT | 52 | 259 | 1 (удаление 3 bp) | ||
Таблица 2: Информация о двух целевых генах, усилении ПЦР и мутациях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TILLING оказался мощным обратным генетическим инструментом для выявления индуцированных мутаций для функционального анализа генов и разведения сельскохозяйственных культур. Для некоторых черт, которые не легко наблюдать или определить, TILLING с высокой пропускной памятью ПЦР на основе мутаций может быть полезным методом для получения мутантов для различных генов. Метод HRM-TILLING был использован в EMS-мутагенизированных популяциях помидоров12,пшеницы11 и виноградной лозы20 для скрининга мутаций. В этой работе был продемонстрирован более простой и мощный HRM-TILLING, применимый как для скрининга мутаций Indel, так и для SBS.
Для повышения эффективности, DNAs были извлечены с помощью метода SSF вместо обычного метода CTAB, который является трудоемким и требует токсичных химических агентов. Si et al.21 сравнили качество ДНК, извлеченной с помощью метода SSF и CTAB. Хотя было установлено, что ДНК из sSF экстракции была чистота ниже, чем в извлечения CTAB, он может отвечать требованиям ПЦР и для анализа HRM в рисе. Однако следует отметить, что ДНК из экстракции SSF долго не могла храниться, поэтому она не подходит для создания постоянной библиотеки мутантов.
В предыдущем исследовании, объединенные образцы с 1/8 мутант ДНК может быть дифференцирована от дикого типа по анализу HRM как в EMS и гамма-мутагенизированных популяций14,19. Учитывая, что растения М2 могут быть гетерозиговыми для индуцированных мутаций, объединение четырех растений М2 было рекомендовано для обнаружения мутаций HRM-TILLING.
Чтобы получить больше мутантов, также важно развивать мутагенизированные популяции с высокой частотой мутаций. Гамма-лучи оказали значительное влияние на рост растений М 1. Было сообщено, что лечение с более высокой дозой привело к увеличению частоты хлорофилла-дефицит мутантов и низкой производительности плодородия, семян набор и высота растений в M2 растений18. Кроме того, известно, что терпимость к мутагенам различается между различными видами. Таким образом, доза, приводящая к летальности около 50% (LD50) в растениях М 1, считалась оптимальной дозой облучения. Тем не менее, Li et al. обнаружили различные дозы мутаций (165, 246 и 389 Gy), что привело к аналогичным показателям мутаций во всем геноме путем повторного изменения, что подразумевало низкую дозу, которая может быть применена для генерации мутаций22.
В этой статье показан пример HRM-TILLING для скрининга мутаций гамма-индуцированных растений. HRM-TILLING, описанный в настоящем документе, также должен быть применим для скрининговых мутаций в популяциях, связанных с EMS-мутагенизированными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальной программой исследований и разработок Китая (No 2016YFD0102103) и Национальным фондом естественных наук Китая (No31701394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G.
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , Manila, the Philippines. (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
