Summary
开发了激光捕获微分体（LCM）协议，以获得足够数量的高质量RNA，用于骨细胞的基因表达分析。目前的研究集中在小鼠股骨部分。然而，这里报道的LCM协议可用于研究任何硬组织细胞的基因表达。
Abstract
RNA的产生和完整性对RNA分析起决定性作用。然而，在整个激光捕获微解剖（LCM）过程中，保持RNA完整性往往在技术上具有挑战性。由于LCM研究对低含量材料起作用，因此对RNA产量有限的担忧也很重要。因此，开发了一种LCM协议，以获得足够数量的高质量RNA，用于骨细胞的基因表达分析。评估了染色方案、冷冻切片厚度、微解剖组织数量、RNA提取试剂盒和LCM系统对从微解剖骨细胞中获得的RNA产量和完整性的影响。八微米厚的冷冻骨部分使用胶膜制成，并使用商业LCM染色的快速协议进行染色。样品夹在聚乙烯对苯二甲酸酯（PET）膜和粘合膜之间。利用重力采集样品和基于柱的RNA提取方法获得足够产量的高质量RNA的LCM系统。目前的研究集中在小鼠股骨部分。然而，这里报道的LCM协议可用于研究任何硬组织细胞在生理条件和疾病过程中的原位基因表达。
Introduction
组织由异构和空间分布的细胞类型组成。给定组织中的不同细胞类型对同一信号的反应可能不同。因此，能够分离特定的细胞群，以评估不同细胞类型在生理和病理条件下的作用是至关重要的。激光捕获微解剖（LCM）提供了一种相对快速和精确的方法，用于从复杂组织1中分离和去除指定的细胞。LCM 系统使用激光束的力量将感兴趣的细胞与组织组织部分分离，而无需酶处理或培养生长。这意味着细胞处于其自然组织栖息地，并且组织架构，包括不同细胞之间的空间关系被保留。捕获的细胞和残余组织的形态保存完好，可以从同一张幻灯片按顺序取样几个组织成分。分离的细胞随后可用于对其RNA、DNA、蛋白质或代谢物含量2、3的后续分析。
为了分析不同细胞群的基因表达，或经过不同的处理，有必要获得足够质量和数量的mRNA，以便随后的分析4，5。与DNA相比，RNA对固定更敏感，当目标是研究RNA时，建议使用冷冻组织。由于 mRNA 因无处不在的核糖核酸酶 （RNase） 而迅速降解，因此在试样处理和制备过程中需要严格的无RNase条件，并避免在室温下储存样品。此外，快速技术没有任何长时间的水相步骤是至关重要的，以防止RNA降解6。RNA的产生和完整性也会受到LCM过程和LCM系统使用7，8的影响。目前，有4个不同操作原理的LCM系统可供2。RNA提取方法也很重要，因为不同的RNA分离试剂盒已经过测试，RNA数量和质量有显著差异，7，8。
任何组织制备方法都需要在获得良好的形态对比和保持RNA完整性之间找到平衡，以便进行进一步分析。为了从骨头中制备冷冻部分，开发了一个粘合膜，并持续改进了9。骨部分被切割并直接在粘结膜上染色。这种胶膜适用于多种染色类型，并可用于使用LCM9、10、11、12、13分离感兴趣的细胞和骨低温细胞。 14.所有步骤，包括手术切除，嵌入，冻结，切割和染色可以在不到一小时的时间内完成。重要的是，细胞，如成骨细胞，骨衬里细胞，和成骨细胞可以清楚地识别9，10，11，12，13，14。该方法具有快速简便的优点。生成骨骼冷冻节的另一种方法是使用磁带传输系统15。然而，后一种技术更耗时，需要额外的仪器，因为部分必须通过紫外线（UV）交联将部分从胶带转移到预涂膜幻灯片上。虽然磁带传输系统已成功与 LCM16、17、18、19结合，但需要注意的是，交联涂层可以创建背景模式，可以干扰细胞类型识别20。
通常，只有少量的RNA从微解剖细胞中提取，RNA的质量和数量通常通过微毛细血管电泳21来评估。计算机程序用于为称为RNA完整性数（RIN）的RNA提取物分配质量指数。RIN值1.0表示完全退化的RNA，而值10.0表示RNA完全完好22。通常，超过5的索引被认为足以用于RNA研究。据报道，RIN值为5.0±10.0的样本中的基因表达模式相互关联良好23。虽然这种方法的灵敏度很高，但由于仅能检测到总RNA的50 pg/μL，但如果样品中的RNA浓度非常低，则很难获得质量评估。因此，为了评估RNA的质量，LCM后剩余的组织部分常被用来提取RNA，通过移液缓冲液移至幻灯片24。
虽然LCM已广泛用于不同的冷冻组织，但提取RNA的RIN值很少报告。此外，没有比较研究来阐明研究小鼠骨骼RNA的最适当方法。在本研究中，使用成年小鼠股骨的冷冻部分优化样品制备、LCM协议和RNA提取，以获得高质量的RNA。本协议特别针对使用重力采集样品的LCM系统进行了优化。
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Protocol
严格按照现行的动物护理指南使用小鼠的骨组织，并竭尽全力将动物的痛苦降到最低。
1. 动物和冷冻嵌入
- 室内动物在恒定室温（RT;24°C）和12小时光/12小时暗循环条件下，可免费获得食物和水。
注：本研究中的骨组织取自3个月大的雄性野生型C57BL/6小鼠。 - 在尸检时，在一般麻醉下从腹腔中分离小鼠（氯胺酮/西拉辛，100/6毫克/千克腹腔内）。
注：为了避免RNA降解，使用无RNase仪器和材料，戴上手套，并在整个实验中快速避免在RT储存样品。 - 快速清除整个股骨，用手术刀和纸巾清洁周围软组织。将最佳切削温度 （OCT） 化合物倒入嵌入模具中，并将股骨放入嵌入模具的底部。将样品在液氮中冷冻。OCT 在 RT 时是透明的，冻结时为白色。
- 完全冷冻后，将样品包裹在铝箔中，并将其转移到干冰上至-80°C。将样品储存在-80°C，直到进一步处理。
注：可以在此处暂停该协议。
2. 部分准备
- 将低温温度设置为 -19 °C，将缸体支架的温度设置为 -17°C。使用 70% 乙醇擦拭冷冻器内部。将一次性刀片用于硬组织、玻璃滑梯和安装工具放入冷冻器中冷却。将它们保存在冷冻室内，持续切片。
- 将干冰上的冷冻组织块转移到冷冻器中，使其平衡至少 10 分钟。
注：避免重复解冻和频繁循环一个块从-80°C到-19°C的冷冻切片。 - 按下嵌入模具的底部，将 OCT 模块推出模具。将足够的 OCT 介质应用于块支架，以将块粘附到块上。等待，直到 OCT 介质完全冻结。
- 将块支架放在物体支架中，并将其拧紧到位。调整刀片位置，并使用 15 μm 切割增量修剪块，以移除覆盖样品的 OCT。如果样品被切得更早，并且表面暴露在空气中，则从块中丢弃前 2⁄3 个组织部分。
- 调整低温可生成 8 μm 截面，并切割 2⁄3 个将丢弃的低温截面（前几个通常比 8 μm 厚）。将粘合膜放在块上，并使用贴合工具将薄膜粘附到块上。缓慢地以恒定的速度握住胶片的截面。
- 将薄膜（样品朝上）立即放在预冷却玻璃滑块上（在低温镜内的低温杆上），以避免样品解冻。使用胶带将薄膜固定到玻璃滑块上，以便更容易染色。立即执行染色协议。
3. 快速染色协议
- 在50 mL管中制备40 mL的以下溶液，并将其放在冰上：95%乙醇、无RNase水、100%乙醇、100%乙醇和100%二甲苯。在冰上执行所有步骤（污渍除外）。对于每个实验日，用无RNase水新鲜制备所有水性试剂。
警告：在引擎盖中工作，以避免二甲苯中毒。 - 在 95% 乙醇中孵育 30 s 部分，然后在无 RNase 水中浸注 30 s 部分，以小心彻底去除 OCT，这可能会干扰 LCM 和下游应用。
- 将 50 μL 的商业 LCM 冷冻截面污渍 （材料表） 涂到该部分，在 RT 孵育 10 s，并通过将滑动边缘放在吸水性纸巾上将其排出。通过在100%乙醇中除去30s的过量污渍。
- 将骨部分浸入第二管中，使用100%乙醇30秒，并将其转移到100%二甲苯30秒。
- 将胶膜（样品朝上）放在干玻璃滑轨上作为支撑。小心薄膜不受影响，并尽可能平放。不要让样品完全干燥。
- 将 PET 膜框架滑块放在其上。很快，用戴手套的手指在薄膜上将其连接到薄膜上。然后，样品夹在膜和粘合膜之间。粘合膜不应折叠或起皱，薄膜和膜之间不应有气泡。立即使用 LCM。
4. 激光捕获微解剖
- 使用表面去污染（材料表）清洁 RNase 的台面和盖架。分别将滑块和盖在滑架和盖架中加载。
- 调整对焦并获取具有 1.25 倍目标的幻灯片概览。更改为 40x 目标并调整焦点。使用幻灯片概述选择感兴趣的区域。调整激光参数如下：光圈，7;激光功率，60;速度， 5;脉冲频率， 201;标本平衡，20。针对每个目标优化这些参数。
- 如果激光无法切割样品，则增加激光功率。或者，激光可以多次应用。此外，检查目标是否有不完整的切口点，并使用"移动"和"切割"选项重新绘制这些点的线。保存激光设置以进行后续幻灯片的解剖。
- 根据形态学标准，选择远端股骨、皮质骨的成骨细胞、骨细胞和骨衬里细胞。为距离目标细胞更远的激光路径绘制一条线，以尽量减少紫外线激光的伤害。染色后不到 1 小时内执行所有微分法。
- 将每种细胞类型收集到 0.5 mL 管的单独盖中。
注：干燥捕获而不是液体回收可以避免RNA降解。此外，微离心管盖中所含的非常小的缓冲液可以在LCM期间蒸发或结晶（取决于其成分）。 - 在 LCM 之后观察收集管盖（如适用），确认捕获成功。立即进行RNA提取。
5. RNA提取
- 将含有β-美卡托乙醇的50 μL的溶酶缓冲液放入收集管的盖子中，通过在瓶盖中上下移液1分钟来分解样品。如果要将多个盖子集中，请注意，RNA提取试剂盒（材料表）建议将缓冲液的总体积。
注意：必须添加β-汞乙醇，以保护RNA免受降解，但它被认为是有毒的。穿戴防护服和手套，在引擎盖上工作。 - 此外，对于每张幻灯片，准备一个标有1.5 mL的微离心管，含有β-汞的溶化缓冲液为350μL。使用LCM后剩余的部分提取RNA。小心地将薄膜与膜分离，并通过将液变缓冲液慢慢移至该部分几次来对样品进行分莱。
注：莱沙缓冲液的总量应为350μL。不要同时使用所有用于消化，因为它会从幻灯片上流出。 -
将酸洗样品放在干冰上，并储存在-80°C。
注：可以在此处暂停该协议。 - 在RT.将从LCM收获的细胞中分离成的细胞从收集管中解冻的分瓶液到1.5 mL微离心管中。如果使用多个盖来采集样品，则汇集多个莱萨。
- 根据制造商的说明提取RNA。用DNase I处理柱，以去除基因组DNA。具有14μL无RN酶水的Elute RNA，产生12μL洗脂酸酯。将RNA储存在-80°C。
注：可以在此处暂停该协议。
6. RNA产量和完整性的测量
- 在湿冰上解冻RNA。使用微毛细血管电泳测量分离RNA的产量和完整性。根据制造商的说明，将总RNA（每个样品1 μL）加载到芯片（材料表）。
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Representative Results
开发了一种LCM协议，以获得足够数量的高质量RNA，用于小鼠股骨细胞的基因表达分析。在优化的协议中，8 μm厚的冷冻骨部分被切割在粘结膜上，并使用商业LCM冷冻截面染色的快速协议进行染色。样品夹在PET膜和粘合膜之间。小鼠骨细胞使用使用重力采集样品的LCM系统进行微解剖。采用基于柱的RNA提取方法获得足够产量的高质量RNA。使用微毛细血管电泳测量了分离RNA的产量和完整性（图1）。
使用不同莱沙方案获得的RNA质量和数量差异可以在代表性凝胶和电眼图中看到。当样品在盖中上下移液1分钟，就可以从1毫米2微解剖骨组织（8μm厚的部分）中分离出大约8.5纳克的RNA。RIN 值为 8.60 （图 2）。
或者，LCM 使用 LCM 系统执行，该系统使用去聚焦激光脉冲，将材料弹射到悬垂的粘合帽中。RNA的质量和数量可以在代表性凝胶和电图中估计。对于新鲜冷冻的骨骼，可以从1毫米2微解剖骨组织（8 μm厚的部分）中分离出大约1.6 ng的RNA。RIN 值为 1 （图 3）。
图1：新鲜冷冻骨骼激光捕获微解剖协议的流程图。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：RNA样品的代表性凝胶（上图）和电检（下图）。LCM 使用使用重力收集样品的 LCM 系统执行。从LCM采集的组织（样品1、3、5、7和9）和相应的对照部分（分别采集的样品2、4、6、8和10）中检索RNA样本。从被染色但未用于LCM（样本11）的对照部分检索到一个RNA样本。对总面积为1mm2的一个进行微解剖，并使用不同的莱沙处理方案。样品1：将含有β-美尔卡托乙醇的溶化缓冲液的350μL加入管中。盖子小心地关上了，管子倒置了。LCM收获的细胞通过涡旋1分钟、在RT孵育10分钟和涡旋1分钟进行分瓶。 样品3：350μL含有β-梅卡托乙醇的溶化缓冲液被添加到收集管中，盖子被小心关闭，管倒置。LCM收获的细胞通过在RT上倒置孵育收集管30分钟进行分解。样品5：50μL含有β-汞的溶化液液加入收集管的盖子中，样品在盖中上下移液，在瓶盖中上下移液1分钟。 将溶酶离心，将含有β-麦卡托乙醇的溶酶缓冲液300μL加入管中。样品7：将含有β-美尔卡托乙醇的溶化缓冲液的350μL加入管中。盖子小心地关上了，管子倒置了。LCM收获的细胞通过涡旋和反转多次被分变。样品9：将含有β-美尔卡托乙醇的溶化缓冲液的50μL添加到收集管的盖中，在盖的RT处通过孵育5分钟来分瓶样品。对溶酶进行离心，将含有β-麦卡托乙醇的溶酶缓冲液300μL加入管中。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：RNA样品的代表性凝胶（上图）和电检（下图）。LCM 使用 LCM 系统执行，该系统使用去聚焦激光脉冲，将材料弹射到位于该部分上方的粘合盖中。从LCM采集的组织（样本5和6）和相应的对照部分（样本7）中检索RNA样本。从被染色但未用于LCM（样本8）的对照部分检索到一个RNA样本。对总面积为 0.5 mm2或 1 mm2进行微解剖（样品 5 和 6 分别分离）。将含有β-美尔卡托乙醇的溶化缓冲液的350μL加入收集管中，小心关闭盖子，管倒置。LCM收获的细胞通过在RT上倒置孵育收集管30分钟来分解。请点击这里查看这个数字的较大版本。
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Discussion
RNA质量和数量在样品制备的所有阶段（如组织操作、LCM 过程和RNA提取）都会受到负面影响。因此，开发了LCM协议，以获得足够数量的高质量RNA，用于后续的基因表达分析。
对于LCM，大多数实验室使用7~8微米厚的2节。较厚的部分将允许收获更多的材料。然而，如果它们太厚，这可能会降低显微分辨率，激光可能无法穿过。最佳组织厚度可能取决于所使用的LCM系统（以及激光和滑动类型），以及问题8、25中的组织。在本研究中，测试了不同厚度（4、8或12μm）的低温节;8 μm厚的部分是LCM的理想选择，而12μm骨部分更难用激光切割，4μm部分的RNA含量较低。
内源性RNase活性因组织而异。因此，为RNase活性极低的组织开发的染色方案可能不适合其他组织类型。核快红26和紫紫24被认为是最好的，在保持RNA的完整性。此外，酒精基方法优于水渍，以保持RNA的完整性。然而，他们遭受不可还原的染色强度27。时间是一个需要考虑的重要参数。一方面，搜索和识别该部分感兴趣的单元格以及执行 LCM 所需的时间通常相对长。另一方面，LCM的可用时间有限，因为在某些情况下，30分钟28分钟后达到20%的RNA降解。因此，为了稳定RNA，采用了不同的方法，例如，在微分部28期间，部分接触龙通量，或使用缓冲的醇基丙基紫罗兰染色，并保持实验室的湿度水平低27.此外，建议微解剖步骤最多15分钟2。在这项研究中，冷冻骨部分被染色使用快速协议的商业LCM染色，即使在RT1小时后，RIN值从8.3下降到9.1。因此，所有微分法在染色后不到1小时内进行。此外，还测试了不同的染色方案（在水性试剂中孵育较短或没有二甲苯步骤）。RIN 值没有显著改善。
在LCM研究中，比较了两种不同类型的RNA提取方法：相分离法与基于柱的方法。结果发现，与相分离法8相比，基于柱的RNA提取方法提高了RNA质量，产量更高。在另一项研究中，一种使用最小消化时间和温度（RT为5分钟）的商业试剂盒与RNA分离试剂盒相比，具有卓越的RNA质量，在较高温度下需要更长的消化时间（在42°C下30分钟）7。在本研究中，可以使用新鲜冷冻小鼠骨骼和基于柱的RNA提取方法，从LCM样品中提取足够浓度的高质量RNA（RIN > 8）。彻底莱沙（在盖中移液1分钟）对于良好的RNA产量至关重要。根据制造商的说明，使用几种不同的RNA分离试剂盒对LCM研究后获得的RNA提取方法对RNA产量和完整性的影响。然而，使用优化协议中使用的试剂盒，获得了更高质量的RNA和增加的数量。在试验研究中，切割了1毫米2最终区域的微解剖组织区域，并有可能使用8μm厚的骨部分（约800 pg/μL）分离出大约8.5纳克的RNA。通常，成骨细胞、骨细胞和骨衬细胞被捕获到每个样本的2⁄3个部分。
不同 LCM 仪器之间的直接比较很少。在一项研究中，测试了两种常见的LCM仪器，它们在所使用的激光类型（分别为紫外线和红外[IR]）和捕获组织的方法（胶合隔离帽与涂有透明热塑性薄膜的盖子）上有所不同。结果发现，对于细切片的新鲜冷冻小鼠大脑部分，红外系统导致RNA质量略高7。在本研究中，比较了两个LCM系统，允许无接触样品采集。在一个系统中，微解剖样品通过重力落入位于略低于29的盖子中。另一个系统使用去聚焦激光脉冲，将材料弹射到悬垂帽30。对于新鲜冷冻骨骼，当使用重力进行组织捕获时，获得更高的RNA量和RIN值。此外，由于 PET 膜的额外重量，弹射技术与由粘膜、低温截面和 PET 膜组成的"三明治"不兼容。
LCM 需要物理访问组织表面。因此，标本的安装和玻璃覆盖不适用，其结果对形态的可视化性有损。为了克服这一限制，开发了一种流体覆盖介质31。或者，10~15 μL乙醇可直接添加到组织部分，在蒸发2之前进行更好的形态分析。在本研究中，冷冻骨部分被切割在粘结膜上，在样品完全干燥之前，它被夹在PET膜和薄膜之间。这种"三明治"方法提供了良好的形态对比，并清楚地识别了特定的骨细胞。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢乌特·泽茨和尼科尔·金纳的出色技术支持，以及Vetcore和动物护理人员的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Glass microscope slides, cut color frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
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