Summary
En LCM-protokoll (laser Capture microdissection) ble utviklet for å oppnå tilstrekkelig mengde av høykvalitets RNA for analyse av genuttrykk i bein celler. Den nåværende studien fokuserer på musen femur seksjoner. Imidlertid kan LCM protokollen som rapporteres her brukes til å studere genuttrykk i celler av noe hardt vev.
Abstract
RNA-utbytte og-integritet er avgjørende for RNA-analyse. Det er imidlertid ofte teknisk utfordrende å opprettholde RNA-integritet gjennom hele laser opptaks microdissection (LCM). Siden LCM-studier arbeider med lave mengder materiale, er det også viktig å ta hensyn til begrensede RNA-avlinger. Derfor ble en LCM-protokoll utviklet for å oppnå tilstrekkelig mengde av høykvalitets RNA for analyse av genuttrykk i bein celler. Effekten av fargeprotokoll, tykkelse av cryosections, microdissected vevs mengde, RNA utvinnings sett og LCM-system som ble brukt på RNA-utbytte og integritet innhentet fra microdissected bein celler ble evaluert. Åtte μm-tykke frosne bein seksjoner ble gjort ved hjelp av en selvklebende film og beiset bruke en rask protokoll for en kommersiell LCM beis. Prøven var klemt mellom en polyetylen polyetylentereftalat (PET) membran og limet film. Et LCM-system som bruker tyngdekraften for prøvetaking samling og en kolonne-basert RNA utvinning metoden ble brukt for å oppnå høy kvalitet RNAs av tilstrekkelig yield. Den nåværende studien fokuserer på musen femur seksjoner. Imidlertid kan LCM protokollen som rapporteres her brukes til å studere in situ genuttrykk i celler av noe hardt vev i både fysiologiske forhold og sykdoms prosesser.
Introduction
Vev består av heterogene og romlig distribuerte celletyper. Forskjellige celletyper i et gitt vev kan reagere forskjellig på det samme signalet. Derfor er det viktig å kunne isolere bestemte celle populasjoner for vurdering av rollen til ulike celletyper i både fysiologiske og patologiske tilstander. Laser fangst microdissection (LCM) tilbyr en relativt rask og presis metode for å isolere og fjerne spesifiserte celler fra komplekse vev1. LCM systemer bruke kraften i en laserstråle for å skille celler av interesse fra histologiske vev seksjoner uten behov for enzymatisk behandling eller vekst i kultur. Dette betyr at cellene er i deres naturlige vev habitat, og at vev arkitektur inkludert romlige forholdet mellom ulike celler beholdes. Morfologi av både fanget celler og det resterende vevet er godt bevart, og flere vevs komponenter kan samples sekvensielt fra samme lysbilde. Isolerte celler kan deretter brukes til senere analyse av RNA, DNA, protein eller metabolitten innhold2,3.
For å analysere genuttrykk i forskjellige celle populasjoner, eller etter ulike behandlinger, er det nødvendig å oppnå mRNAs av tilstrekkelig kvalitet og kvantitet for den påfølgende analysen4,5. I motsetning til DNA, RNAs er mer følsomme for fiksering og bruk av frossen vev anbefales når målet er å studere RNA. Siden mRNAs raskt forringes av allestedsnærværende ribonucleases (RNase), er strenge RNase-frie forhold under prøvehåndtering og-tilberedning og å unngå lagring av prøver ved romtemperatur nødvendig. I tillegg er raske teknikker uten langvarige vandige fase trinn avgjørende for å hindre RNA-forringelse6. Den RNA yield og integritet kan også påvirkes av LCM prosessen og LCM systemet brukes7,8. Foreløpig er fire LCM systemer med ulike driftsprinsipper tilgjengelig2. Metoden for RNA-ekstraksjon kan også være viktig, siden ulike RNA isolasjons sett har blitt testet med betydelige forskjeller i RNA-kvantitet og kvalitet på7,8.
Enhver vevs Forberedelses metode krever å finne en balanse mellom å oppnå god morfologiske kontrast og opprettholde RNA integritet for videre analyser. For å forberede frosne seksjoner fra bein, ble en selvklebende film utviklet og kontinuerlig forbedret9. Benet seksjoner er kuttet og beiset direkte på limet filmen. Denne selvklebende filmen gjelder for mange typer farging, og kan brukes til å isolere cellene av interesse fra bein cryosections bruker LCM9,10,11,12,13, 14i det. Alle trinnene inkludert kirurgisk fjerning, innebygging, frysing, skjæring og farging kan gjennomføres innen mindre enn en time. Viktigere, celler som osteoblaster, bein fôr celler, og osteoklaster kan tydelig identifiseres9,10,11,12,13,14. Denne metoden har fordelen av å være rask og enkel. En alternativ metode for generering av bein cryosections er å bruke bånd overføringssystemet15. Men den sistnevnte teknikken er mer tidkrevende og krever ekstra instrumentering, siden seksjonene må overføres fra selvklebende tape på precoated membran lysbilder av ultrafiolett (UV) kryss-linking. Selv om tape Transfer systemet har blitt koblet sammen med LCM16,17,18,19, bør det bemerkes at tverrbundet belegg kan skape et bakgrunnsmønster som kan forstyrre celle type identifikasjon20.
Vanligvis trekkes bare små mengder RNA ut fra microdissected celler, og RNA-kvalitet og kvantitet vurderes ofte av mikro-kapillær elektroforese21. Et dataprogram brukes til å tilordne en indeks av kvalitet til RNA-ekstrakter som kalles RNA-nummer ((RIN)). En RIN-verdi på 1,0 indikerer fullstendig degradert RNA, mens en verdi på 10,0 antyder at RNA-en er helt intakt22. Vanligvis anses indekser over 5 som tilstrekkelige for RNA-studier. Gen uttrykks mønstre i prøver med en RIN-verdi på 5,0 − 10.0 har blitt rapportert å koordinere godt med hverandre23. Selv om følsomheten til denne metoden er høy, siden så lite som 50 PG/μL av total RNA kan oppdages, kan det være svært vanskelig å få en kvalitetsvurdering hvis RNA-konsentrasjonen i prøven er svært lav. Derfor, for å vurdere RNA kvalitet, er vevs delen som gjenstår etter LCM ofte brukt til å trekke ut RNA, ved pipettering buffer på Slide24.
Selv om LCM har blitt brukt mye på forskjellige frosne vev, RIN verdier av utpakkede RNAs er sjelden rapportert. Videre er det ingen sammenlignende studier for å avklare den mest hensiktsmessige metoden for å studere RNA i mus bein. I denne studien, frosne seksjoner fra voksen mus femurs ble brukt til å optimalisere prøve forberedelser, LCM protokoll og RNA utvinning for å oppnå høy kvalitet RNAs. Den nåværende protokollen ble optimalisert spesielt for LCM-systemet som bruker tyngdekraften for prøvetaking samling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Benvev fra mus ble brukt i nøye samsvar med rådende retningslinjer for dyr omsorg og alle anstrengelser ble gjort for å minimere dyr lidelse.
1. dyr og Frys embedding
- Husdyr i forhold med konstant romtemperatur (RT; 24 ° c) og en 12 h lys/12 h mørk syklus med fri tilgang til mat og vann.
Merk: bein vev i denne studien ble innhentet fra 3-måneders gammel mannlig vill type C57BL/6 mus. - På obduksjon, exsanguinate mus fra abdominal vena cava under narkose (ketamin/xylazine, 100/6 mg/kg intraperitoneal).
Merk: For å unngå RNA-forringelse, bruk RNase-frie instrumenter og materialer, bruk hansker og arbeid raskt med å unngå lagring av prøver på RT gjennom hele eksperimentet. - Fjern hele femurs raskt, rengjør dem av omgivende bløtvev ved hjelp av skalpell og papirhåndklær. Hell optimal skjæring temperatur (OCT) sammensatte i embedding mold, og sette femur i bunnen av embedding mold. Snap-Frys prøvene i flytende nitrogen. OCT er gjennomsiktig på RT og hvitt når frosset.
- Når helt frosset, Pakk prøvene i folie og overføre dem på tørr is til-80 ° c. Lagre prøver ved-80 ° c inntil videre behandling.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her.
2. forberedelse av seksjonen
- Still inn temperaturen i kryostaten til-19 ° c og av blokk holde ren til-17 ° c. Tørk av kryostaten innvendig med 70% etanol. Plasser engangsbladet for harde vev, glass lysbilder og et Tilpasningsverktøy i kryostaten for å avkjøle. Oppbevar dem inne i kryostaten for varigheten av snitting.
- Overfør den frosne vev blokken på tørr is til kryostaten og la den likevekt i minst 10 min.
Merk: Unngå repeterende tine og hyppig sykling av en blokk fra-80 ° c til-19 ° c for kryosnitt. - Trykk på bunnen av embedding mold å skyve OCT blokken ut av mold. Påfør nok OCT medium til blokk holde ren for å overholde blokken. Vent til OCT-mediet er helt frosset.
- Plasser blokk holde ren i objektholderen, og stram den på plass. Juster blad posisjonen og trim blokken med 15 μm kutte trinn for å fjerne OCT dekker prøven. Hvis prøven har blitt kuttet tidligere og overflaten utsettes for luft, kast de første 2 − 3 vevs delene fra blokken.
- Juster kryostaten for å generere 8 μm seksjoner og klipp 2 − 3 cryosections som skal kastes (de første vil vanligvis være tykkere enn 8 μm). Plasser lim filmen på blokken og bruke et passende verktøy for å holde filmen til blokken. Gjør kuttet langsomt og med en konstant hastighet holde delen av filmen.
- Plasser filmen (prøven vendt opp) umiddelbart på et forkjøles glass (på cryobar i kryostaten) for å unngå å tine av prøven. Bruk tape for å fikse filmen til glass Slide for enklere farging. Fortsett umiddelbart med farge protokollen.
3. rask farging protokollen
- Forbered 40 mL av følgende løsninger i 50 mL rør og legg dem på is: 95% etanol, RNase-fritt vann, 100% etanol, 100% etanol og 100% xylen. Utfør alle trinnene på isen (bortsett fra farging). For hver eksperimentelle dag skal alle vandige reagenser tilberedes friskt med RNase vann.
Forsiktig: Arbeid i panseret for å unngå forgiftning av xylen. - Ruge seksjoner for 30 s i 95% etanol, deretter dyppe seksjoner 30 s i RNase-fritt vann for å fjerne OCT nøye og fullstendig som kan forstyrre LCM og nedstrøms applikasjoner.
- Dispensere 50 μL av kommersiell LCM frossen Seksjons flekk (tabell av materialer) på seksjonen, ruge for 10 s ved RT og Tøm den ved å plassere kanten av raset på absorberende papir. Fjern overflødig beis ved skylling 30 s i 100% etanol.
- Dypp Ben seksjoner i et annet rør med 100% etanol for 30 s og Overfør dem til 100% xylen i 30 s.
- Sett lim film (prøven vendt opp) på tørt glass lysbilde som en støtte. Pass på at filmen ikke blir påvirket og plassert så flat som mulig. Ikke la prøven tørke helt.
- Plasser en PET membran ramme lysbilde på den. Trykk kort på en hansker finger på membranen for å feste den til filmen. Prøven er så klemt mellom membranen og limet filmen. Den selvklebende filmen skal ikke brettes eller rynket, og det bør ikke være noen luftbobler mellom filmen og membranen. Fortsett umiddelbart med LCM.
4. laser fange Microdissection
- Rengjør scenen og cap holderen fra RNase ved hjelp av overflate dekontaminant (tabell av materialer). Legg i lysbildet og dekslene henholdsvis i lysbildeholderen og deksel holde ren.
- Juster fokus og Hent lysbilde oversikt med 1,25 x mål. Bytt til 40x-målet og Juster fokuset. Velg interesseområdet ved hjelp av lysbilde oversikten. Juster laser parametre som følger: blenderåpning, 7; laser kraft, 60; hastighet, 5; pulsfrekvens, 201; prøve balanse, 20. Optimaliser disse parameterne for hver målsetting.
- Hvis laseren ikke klarer å kutte prøven, må du øke laser strømmen. Alternativt kan laseren påføres mer enn én gang. I tillegg inspisere målet for flekker av ufullstendige kutt og re-tegnet linjen i disse stedene ved hjelp av Flytt og kutt alternativet. Lagre laser innstillinger for Disseksjon av etterfølgende lysbilder.
- Velg osteoblaster, osteocytter og bein fôr celler i cancellous eller kortikale bein basert på morfologiske kriterier. Tegn en linje for laser bane lenger bort fra målcellene for å minimere skaden fra UV-laseren. Utfør alle microdissections innen mindre enn 1 time etter farging.
- Samle hver celle type i et eget lokk på et 0,5 mL rør.
Merk: Tørr fangst i stedet for væskeutvinning kan unngå RNA-forringelse. I tillegg kan svært små volumer av buffer som finnes i hetten på mikrosentrifugen røret enten fordampe eller utkrystallisere (avhengig av sammensetning) under LCM. - Bekreft fangst suksess ved observasjon av samlingen tube cap etter LCM der det er aktuelt. Fortsett umiddelbart med RNA-ekstraksjon.
5. RNA-ekstraksjon
- Dispensere 50 μL av lyseringsbufferen som inneholder β-mercaptoethanol i hetten på prøvetakingsrøret og lyse prøven ved å pipettering opp og ned i hetten i 1 min. snurr ned lysat og tilsett 300 μL av lyseringsbufferen som inneholder β-mercaptoethanol inn i slangen. Hvis flere caps kommer til å bli samlet, pass på at det totale volumet av buffer er som anbefalt for RNA Extraction Kit (tabell av materialer).
Advarsel: β-mercaptoethanol må tilsettes for å beskytte RNA fra degradering, men det anses som giftig. Bruk verneklær og hansker og arbeid i hetten. - I tillegg lager for hvert lysbilde en merket 1,5 mL mikrosentrifugen rør med 350 μL av lyseringsbuffer som inneholder β-mercaptoethanol. Bruk delene som gjenstår etter LCM for å trekke ut RNA. Forsiktig skille filmen fra membranen og lyse prøven ved langsomt pipettering lyseringsbuffer på den delen flere ganger.
Merk: Total mengde lyseringsbuffer bør være 350 μL. Ikke bruk alt på en gang for fordøyelsen som det vil flyte av lysbildet. -
Sett lysat prøver på tørr is og oppbevar dem ved-80 ° c.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. - Tin lysater ved RT. Transfer-lysater fra LCM-høstet celler fra innsamlings rør til 1,5 mL mikrosentrifugen rør. Hvis mer enn én lue ble brukt til å høste prøven, bassenget flere lysater.
- Trekk ut RNA i henhold til produsentens anvisninger. Behandle kolonner med DNase jeg å fjerne genomisk DNA. Eluere RNA med 14 μL av RNase-fritt vann, som resulterer i en 12 μL eluatet. Lagre RNA ved-80 ° c.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her.
6. måling av RNA-utbytte og integritet
- Tin RNA på våt is. Mål avkastningen og integriteten til isolert RNA ved hjelp av mikro-kapillær elektroforese. Last total RNA (1 μL per prøve) i en chip (tabell av materialer) i henhold til produsentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En LCM-protokoll ble utviklet for å oppnå tilstrekkelig mengde av høykvalitets RNA for analyse av genuttrykk i bein celler med muse femurs. I optimalisert protokollen, 8 μm-tykke frosne bein seksjoner ble kuttet på en selvklebende film og beiset ved hjelp av en rask protokoll for en kommersiell LCM frosne delen flekken. Prøven var klemt mellom PET membranen og limet film. Mouse bein celler ble microdissected ved hjelp av et LCM system som bruker tyngdekraften for prøvetaking samling. En Kol onne BAS ert RNA utvinningsmetode ble brukt for å oppnå en høykvalitets RNA med tilstrekkelig utbytte. Avkastningen og integriteten til isolert RNA ble målt ved hjelp av mikro-kapillær elektroforese (figur 1).
Forskjellen i RNA kvalitet og mengde oppnådd ved bruk av forskjellige lyse Rings protokoller kan sees i den representative gel og electropherograms. Når prøven ble lysert av pipettering opp og ned i hetten i 1 min, var det mulig å isolere omtrent 8,5 ng av RNA fra 1 mm2 microdissected benvev (8 μm-tykk seksjon). RIN-verdien var 8,60 (figur 2).
Alternativt ble LCM utført ved hjelp av en LCM system som bruker de-fokuserte laser puls, som katapulter materialet inn i overhengende limet cap. RNA-kvalitet og-kvantitet kan anslås i den representative gel-og electropherograms. For friske frosne bein, var det mulig å isolere omtrent 1,6 ng av RNA fra 1 mm2 microdissected benvev (8 μm-tykk seksjon). RIN-verdien var 1 (Figur 3).
Figur 1: flytskjema for laser fangst microdissection protokoll for fersk-frosne bein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representativ gel (øverst) og electropherograms (nederst) til RNA-prøver. LCM ble utført ved hjelp av et LCM-system som bruker tyngdekraften for prøvetaking samling. RNA-prøvene ble Hentet fra LCM-høstet vev (prøver 1, 3, 5, 7 og 9) og tilhørende kontroll seksjoner (prøvene 2, 4, 6, 8, og 10, henholdsvis). En RNA-prøve ble Hentet fra kontroll delen som ble farget, men ble ikke brukt til LCM (Sample 11). Et samlet areal på 1 mm2 var microdissected, og forskjellige lyse Rings protokoller ble brukt. Eksempel 1:350 μL av lyseringsbufferen som inneholder β-mercaptoethanol, ble tilsatt i slangen. Hetten ble lukket nøye, og røret invertert. LCM-høstet celler ble lysert av virvlingen 1 min, incubating ved RT i 10 min og virvlingen 1 min. sample 3:350 μL av lyseringsbufferen som inneholder β-mercaptoethanol ble tilsatt i oppsamlings røret, hetten ble nøye lukket, og røret invertert. LCM-høstet celler ble lysert av incubating samling rør opp ned i 30 min ved RT. sample 5:50 μL av lyseringsbufferen som inneholder β-mercaptoethanol ble tilsatt i hetten på oppsamlings røret, og prøven ble lysert av pipettering opp og ned i hetten i 1 min. Lysat var sentrifugert og 300 μL av lyseringsbufferen som inneholdt β-mercaptoethanol, ble tilsatt i slangen. Eksempel 7:350 μL av lyseringsbufferen som inneholder β-mercaptoethanol, ble tilsatt i slangen. Hetten ble lukket nøye, og røret invertert. LCM-høstet celler ble lysert av virvlingen og invertere flere ganger. Sample 9:50 μL av lyseringsbufferen som inneholder β-mercaptoethanol ble tilsatt i hetten på prøvetakingsrøret, og prøven ble lysert av inkubasjons i 5 minutter ved RT i hetten. Lysat var sentrifugert, og 300 μL av lyseringsbufferen som inneholdt β-mercaptoethanol ble tilsatt til slangen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bilde 3: representativ gel (øverst) og electropherograms (nederst) til RNA-prøver. LCM ble utført ved hjelp av et LCM-system som bruker de-fokuserte laser puls, som katapulter materialet inn i limet hetten plassert overdelen. RNA-prøvene ble Hentet fra LCM-høstet vev (prøver 5 og 6) og tilhørende kontroll seksjon (prøve 7). En RNA-prøve ble Hentet fra kontroll delen som ble farget, men ble ikke brukt til LCM (prøve 8). Et samlet areal på 0,5 mm2 eller 1 mm2 var microdissected (henholdsvis prøver 5 og 6). 350 μL av lyseringsbufferen som inneholder β-mercaptoethanol ble tilsatt i prøvetakingsrøret, hetten ble nøye lukket og røret invertert. LCM-høstet celler ble lysert av incubating samling rør opp ned i 30 min på RT. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Både RNA-kvalitet og-mengde kan påvirkes negativt på alle stadier i prøve forberedelsen, for eksempel vevs manipulasjon, LCM-prosessen og RNA-ekstraksjon. Derfor ble en LCM-protokoll utviklet for å oppnå tilstrekkelig mengde av høykvalitets RNA for påfølgende analyse av genuttrykk.
For LCM bruker de fleste laboratorier seksjoner 7 − 8 μm tykke2. Tykkere seksjoner ville tillate mer materiale som skal høstes. Men hvis de er for tykke, kan dette redusere mikroskopisk oppløsning og laseren kan ikke være i stand til å skjære gjennom. Det er sannsynlig at optimal vevs tykkelse avhenger av LCM systemet (og laser og skyv type) som brukes, så vel som på vevet i spørsmålet8,25. I denne studien ble cryosections av forskjellige tykkelser (4, 8 eller 12 μm) testet; 8 μm-tykke seksjoner ble funnet å være ideell for LCM, mens 12 μm bein seksjoner var vanskeligere å skjære med laser og 4 μm seksjoner ga lavere mengder RNA.
Den endogene RNase aktivitet varierer mellom ulike vev. Derfor, farging protokoller utviklet for vev med svært lav RNase aktivitet kan være uegnet for andre typer vev. Nuclear rask rød26 og cresyl Violet24 ble foreslått å være den beste i forhold til å bevare RNA integritet. I tillegg var alkoholbasert metoder overlegne i henhold til vandige flekker for å opprettholde RNA-integritet. Men de led av ved uforklarlige farging intensitet27. Tid er en viktig parameter å vurdere. På den ene siden, tiden det tar å søke og identifisere celler av interesse i seksjonen, og å utføre LCM er ofte relativt lang. På den annen side, tid tilgjengelig for LCM er begrenset, siden, i noen tilfeller, 20% RNA degradering ble nådd etter 30 min28. Derfor ble forskjellige metoder brukt for å stabilisere RNA, slik som eksponering av seksjoner til Argon Flux under microdissection28, eller bruk av bufrede alkohol-baserte cresyl fiolett farging og holde luftfuktigheten i laboratoriet lav 27. i tillegg ble maksimalt 15 minutter for det microdissection steget foreslått2. I denne studien, frosne bein seksjoner ble farget ved hjelp av en rask protokoll for en kommersiell LCM flekken, og selv etter 1 time ved RT, er RIN verdier redusert fra 8,3 til 9,1. Derfor ble alle microdissections utført innen mindre enn 1 time etter farging. I tillegg ble forskjellige protokoller for farging testet (med kortere incubations i vandige reagenser eller uten xylen trinn). Ingen signifikant bedring i RIN-verdier ble oppnådd.
I LCM studier har to ulike typer RNA utvinningsmetoder blitt sammenliknet: en fase separasjon metode kontra en kolonne-basert metode. Det ble funnet at RNA utvinnings metoden basert på søyler førte til bedre RNA kvalitet og høyere utbytte sammenlignet med fase separasjon metoden8. I en annen studie, en kommersiell kit som bruker minimal fordøyelse tid og temperatur (5 min ved RT) resulterte i overlegen RNA kvalitet sammenlignet med en RNA isolasjons sett som trenger lengre fordøyelsen tid ved høyere temperatur (30 min ved 42 ° c)7. I denne studien var det mulig å utvinne høykvalitets RNA (RIN > 8) med tilstrekkelig konsentrasjon fra LCM-prøver med fersk frosset mus bein og en Kol onne BAS ert RNA utvinningsmetode. Grundig lyse Rings (1 min pipettering i hetten) er essensielt for god RNA-utbytte. Effekten av RNA utvinnings metoden på RNA-avkastningen og integriteten som ble oppnådd etter LCM ble undersøkt ved hjelp av flere forskjellige RNA isolasjons sett i henhold til produsentens instruksjoner. Men bedre kvalitet RNAs og økt kvantitet ble innhentet med kit som brukes i den optimaliserte protokollen. I forsøks studien ble microdissected vevs regioner på 1 mm2 slutt område kuttet, og det var mulig å isolere omtrent 8,5 ng av RNAs ved hjelp av 8-μm-tykke Ben seksjoner (ca. 800 PG/μL). Vanligvis ble osteoblaster, osteocytter og bein fôr celler fanget i 2 − 3 seksjoner per prøve.
Direkte sammenligninger mellom ulike LCM-instrumenter er knappe. I en studie, to vanlige LCM instrumenter ble testet, som varierer i den type laser som brukes (UV og infrarød [IR], henholdsvis) og metode for å fange vev (selvklebende isolasjon cap vs caps belagt med transparent termoplastisk film, henholdsvis). Det ble funnet at for tynt-delt fersk-frosne musen hjernen seksjoner, det IR-systemet resulterte i beskjedent høyere RNA kvalitet7. I denne studien ble to LCM-systemer som tillater Kontaktfri prøve samling sammenlignet. I ett system, faller microdissected prøven ved tyngdekraften inn i hetten plassert like under29. Et annet system bruker en de-fokusert laser puls, som katapulter materialet inn i hengende cap30. For fersk frosne bein ble høyere RNA-beløp og RIN-verdier innhentet når tyngdekraften ble brukt til å fange vev. I tillegg er catapulting teknologi ikke kompatibel med "sandwich" består av selvklebende film, fryse-delen, og PET membran, på grunn av den ekstra vekten av PET membranen.
LCM krever fysisk tilgang til vevs overflaten. Derfor er montering og glass belegg av prøven uanvendelig, med konsekvensen av nedsatt visualisering av morfologi. For å overkomme denne begrensningen ble et væske deksel medium utviklet31. Alternativt kan 10 − 15 μL av etanol tilsettes direkte på vevs delen, noe som muliggjør bedre morfologiske analyser før fordampning2. I denne studien, frosne bein seksjoner ble kuttet på en selvklebende film, og før prøven ble tillatt å tørke helt, var det klemt mellom PET membranen og filmen. Denne "sandwich" metoden ga gode morfologiske kontrast og spesifikke bein celler var tydelig identifisert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker ute Zeitz og Nikole Ginner for deres utmerkede teknisk hjelp samt Vetcore og dyr omsorg ansatte for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Glass microscope slides, cut color frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Humana Press. New York, NY. 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
